提高耐熱鏈霉菌轉化泰樂菌素能力的分子育種改造.pdf

1、乙酰異戊酰泰樂菌素(AIV)是一種高效的大環(huán)內酯類抗生素，有著很高的工業(yè)應用價值。它是通過耐熱鏈霉菌生物轉化泰樂菌素，在泰樂菌素的3-OH乙?；?"-OH異戊酰基化而獲得。本研究希望通過在耐熱鏈霉菌中分別整合acyB1-B2基因、ermE基因和中斷nsdA基因三個方面的分子改造，以提高泰樂菌素轉化率。 本研究首先通過搖瓶裝量、轉種量、種齡、發(fā)酵培養(yǎng)周期4個搖瓶發(fā)酵參數(shù)的研究，初步確定了耐熱鏈霉菌搖瓶發(fā)酵的最佳工藝流程。出發(fā)菌

2、株經(jīng)二級種子培養(yǎng)24h后，以10％的轉種量，轉種到35mL發(fā)酵培養(yǎng)基，48h后補加泰樂菌素和亮氨酸，補料48h測轉化率，出發(fā)菌株泰樂菌素轉化率穩(wěn)定在70％。 AcyA負責乙?；δ?，acyB1-B2負責異戊?；δ埽琣cyB2基因是acyB1基因的正調控基因。本研究將acyB1-B2基因單獨克隆出來，插入pIJ8600構建成整合表達載體pBIB425，導入耐熱鏈霉菌工業(yè)菌株BIB0830中，得到重組菌株BIB425。HPLC

3、分析表明，與出發(fā)菌株BIB0830相比，BIB425泰樂菌素轉化率提高了14％。結果表明單獨增加acyB1基因拷貝數(shù)不足以提高耐熱鏈霉菌的異戊?；富睿琣cyB2基因的激活作用在整個?；^程中至關重要。 ErmE基因類似于carB基因，編碼核糖體雙甲基化酶。本研究以pIJ8600為出發(fā)菌株，構建了ermE(ermEp*)基因的整合表達載體pBIB304。通過屬間接合轉移，整合到BIB0830中，抗性篩選和PCR驗證得到陽性克

4、隆BIB304。結果表明重組菌株BIB304在固體平皿和液體YEME培養(yǎng)基中對泰樂菌素的耐受性均從100μg/mL提高到900μg/mL。在搖瓶水平上，導入紅霉素的抗性基因對耐熱鏈霉菌生物量和轉化泰樂菌素無明顯影響。 本研究還對在鏈霉菌中普遍存在的負調控基因nsdA進行了研究。通過接合轉移nsdA基因中斷載體pBIB308，得到nsdA基因中斷突變株BIB308。HPLC結果顯示：在搖瓶水平上，BIB308的泰樂菌素轉化率提高了