基于拉曼光譜的地中海貧血紅細(xì)胞判別和攜氧功能研究.pdf

1、紅細(xì)胞是血液中數(shù)量最多的一種細(xì)胞，在人體新陳代謝和氣體運(yùn)輸方面起著非常重要的作用，其機(jī)能主要由胞內(nèi)的血紅蛋白完成。而外部環(huán)境的變化，如滲透壓、藥物處理、氧氣分壓等可能引起紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白分子構(gòu)象發(fā)生變化。研究紅細(xì)胞及其血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有助于深入了解紅細(xì)胞的攜氧功能甚至血液疾病的病理，為診斷和治療提供理論依據(jù)。地中海貧血（簡稱地貧）是一種由于珠蛋白基因缺失或缺陷使珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血。該疾病在我國南

2、方地區(qū)發(fā)病率較高，主要分為α-地貧和β-地貧兩種類型。目前尚無有效的根治方法，只能篩查地貧患者，避免重型地貧患兒的出生以控制該病的蔓延。但常規(guī)的基于細(xì)胞群體或血紅蛋白的檢測方法，操作繁瑣，工作量大，費(fèi)用相對昂貴，不適合大面積人群的篩查。此外，研究指出地貧紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化在攜氧能力上也表現(xiàn)出差異。因此，發(fā)展一種快速簡便、低成本的地貧檢測方法，及監(jiān)測紅細(xì)胞的氧合和去氧的動力學(xué)行為，評價其攜氧功能具有重要的臨床應(yīng)用意義。 作為一種無損

3、、快速而靈敏的光譜學(xué)檢測方法，拉曼光譜技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日漸廣泛。由于水的拉曼散射非常微弱，因此該技術(shù)適合于水溶液環(huán)境中的生物大分子、細(xì)胞等的研究。激光鑷子和顯微拉曼光譜相結(jié)合的光鑷?yán)庾V（Laser tweezers Ramanspectroscopy，LTRS）技術(shù)，利用光鑷俘獲和囚禁細(xì)胞，可消除普通顯微拉曼光譜技術(shù)將細(xì)胞固定在玻片上所引起的不良影響，并獲得信噪比更高的光譜。LTRS技術(shù)在單個功能紅細(xì)胞的研究中已表現(xiàn)其獨(dú)特的

4、優(yōu)勢。有望實(shí)現(xiàn)地貧的診斷和攜氧功能的研究。但系統(tǒng)噪聲和熒光效應(yīng)等引起的高強(qiáng)度的光譜背景，將降低譜線強(qiáng)度與背景的比值，以至于嚴(yán)重影響了基于光譜強(qiáng)度的分析結(jié)果。因此進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)有效處理是必要的。 本文應(yīng)用LTRS系統(tǒng)收集正常對照、中間型α-地貧（HbH、HbH-CS）和重型β-地貧的紅細(xì)胞的拉曼光譜，采用最小二乘多項(xiàng)式曲線擬合進(jìn)行光譜背景（也稱基線）校正，聚類分析、主成分分析、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等用于光譜數(shù)據(jù)壓縮或模式識別，實(shí)現(xiàn)不同地貧類型的

5、判別。 此外，分析單細(xì)胞的氧合及去氧動力學(xué)過程及細(xì)胞差異性。主要開展了以下四個研究工作： （1）針對系統(tǒng)噪聲和熒光效應(yīng)等引起高強(qiáng)度光譜背景影響基于光譜強(qiáng)度的統(tǒng)計分析結(jié)果的問題，利用最小二乘多項(xiàng)式進(jìn)行光譜背景的擬合并去除背景。通過對比不同的數(shù)據(jù)處理方法聚類分析結(jié)果，表明最小二乘多項(xiàng)式曲線擬合進(jìn)行光譜基線校正可顯著提高地貧紅細(xì)胞與正常人紅細(xì)胞的識別度。其中，α-地貧HbH組與正常對照組間的平均區(qū)分度為90.32％，α-地貧H

6、bH-CS組與正常對照組間的區(qū)分度97.6％，遠(yuǎn)高于其他處理方法的結(jié)果。而且，該方法對實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)穩(wěn)定性要求不高。 （2）將主成分分析（PCA）算法和BP網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型相結(jié)合，進(jìn)行地貧紅細(xì)胞類型的判別。PCA 結(jié)果顯示，正常對照與α-地貧HbH-CS基本可區(qū)分，但正常對照與重型β-地貧、α-地貧HbH-CS 與重型β-地貧間差異不明顯。將歸一化處理的前五個主成分進(jìn)行BP網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練及預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對照與α-地貧HbH-CS 間預(yù)測正

7、確率高達(dá)97.90％，正常對照與重型β-地貧、α-地貧HbH-CS 與重型β-地貧間預(yù)測正確率分別為90.72％和86.28％。該結(jié)果與平均拉曼光譜及主成分分析結(jié)果基本吻合。取不同的實(shí)驗(yàn)條件下收集的光譜進(jìn)行同樣的分析，三種組合的預(yù)測正確率略有不同，分別為95.28％，92.08％，91.85％，但呈現(xiàn)基本相同的規(guī)律。 （3）激光鑷子共焦顯微拉曼光譜與氣體控制裝置相結(jié)合，窺視紅細(xì)胞的攜氧能力。分析激光功率對氧合狀態(tài)分析的影響，氧合

8、態(tài)和去氧態(tài)的對比及區(qū)分指標(biāo)的選擇，并運(yùn)用該指標(biāo)分析了不同保存時間、不同健康狀態(tài)紅細(xì)胞的攜氧能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較強(qiáng)功率的激光照射細(xì)胞會導(dǎo)致其亞鐵血紅素聚合特征峰1248 cm-1、1371 cm-1升高； I1638/I1547 是區(qū)分氧合態(tài)與去氧態(tài)的良好標(biāo)志；經(jīng)較長時間保存的紅細(xì)胞氧合能力增強(qiáng)，但去氧能力沒有發(fā)生顯著性變化；α-地貧HbH-CS 紅細(xì)胞氧合能力比正常對照的強(qiáng)，但其去氧能力較差。 （4）應(yīng)用光鑷?yán)庾V系統(tǒng)監(jiān)

9、測地貧和正常對照單個紅細(xì)胞氧循環(huán)過程光譜的變化。在單細(xì)胞的水平上研究α-地貧HbH-CS和正常對照功能紅細(xì)胞氧合及去氧能力。比較分析α-地貧HbH-CS和健康個體單個紅細(xì)胞的氧循環(huán)過程的氧合及去氧能力及去氧態(tài)群體紅細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在氧循環(huán)的去氧態(tài)中，α-地貧HbH-CS的I1638/I1547 顯著高于正常對照；氧合態(tài)其I1638/I1547 也略高于正常對照。群體統(tǒng)計中，若以小于正常對照I1638/I1547的平均值為去氧態(tài)基準(zhǔn)，則正