BMP4與noggin在大鼠顳葉癲癇模型齒狀回顆粒細胞異常增生中的作用.pdf

1、癲癇是一種由多種病因引起，腦部神經(jīng)元高度同步化，且常有自限性的異常過度放電所致的突然、反復和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常，常合并局部結(jié)構(gòu)、代謝及局部腦血流改變，是神經(jīng)科常見的一組慢性疾病。傳統(tǒng)上將非繼發(fā)于神經(jīng)系統(tǒng)或其它系統(tǒng)疾病，僅有發(fā)作期或/和發(fā)作間期腦的電生理學改變者稱為“原發(fā)性癲癇”。經(jīng)正規(guī)抗癲癇藥物治療，大多數(shù)病人的癲癇發(fā)作可得到控制，但仍有20-30％的病人癲癇難以控制，最終發(fā)展為難治性癲癇，其中60％～70％為顳葉癲癇(temp

2、oral lobe epilepsy，TLE)，目前顳葉癲癇的發(fā)病機制尚未完全闡明。長期反復發(fā)作及藥物副作用嚴重威脅著顳葉癲癇病人的日常生活，因此，對于顳葉癲癇發(fā)病機制的研究，具有重要意義。 海馬是顳葉癲癇的主要致癇灶，是其它類型癲癇放電擴散的中繼站和放大器。同時海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)及室下區(qū)(Subventricularzone，SVZa)也是成年哺乳動物腦內(nèi)兩個神經(jīng)發(fā)生最集中的部位。顳葉癲癇最常見且最

3、主要的病理變化為海馬硬化(hippocampus sclerosis)，包括神經(jīng)細胞脫失，膠質(zhì)增生和突觸重組。苔蘚纖維芽生(mossy fiber sprouting，MFS)是顳葉癲癇突觸重組的主要形式，以齒狀回顆粒細胞、內(nèi)嗅區(qū)及CA3區(qū)常見。大量顳葉癲癇患者病灶標本和動物模型研究均觀察到，癲癇所致的腦損傷發(fā)生后，齒狀回顆粒細胞軸突(苔蘚纖維)出芽，海馬神經(jīng)發(fā)生增加，門區(qū)異位顆粒細胞形成等現(xiàn)象。海馬CA1、CA3區(qū)錐體細胞和門區(qū)神經(jīng)元

4、致癇損傷后，內(nèi)分子層失神經(jīng)傳入同時苔蘚纖維也與靶細胞斷離，因而觸發(fā)苔蘚纖維出芽進入內(nèi)分子層并與顆粒細胞建立突觸聯(lián)系。越來越多的研究表明：苔蘚纖維出芽與慢性癲癇反復的自發(fā)性發(fā)作有關，同時又可增強癲癇的反復發(fā)作。但新生顆粒細胞增殖、遷移、分化并參與癲癇發(fā)作的病理機制及MFS的確切功能，目前尚不清楚。 研究表明，在海人酸(Kainic acid，KA)致海馬損傷后，海馬齒狀回下顆粒層神經(jīng)發(fā)生增加，并伴有神經(jīng)細胞遷移和神經(jīng)細胞突觸可塑性

5、的增加。我們和國外同行近期均觀察到顳葉癲癇發(fā)病過程中存在海馬神經(jīng)發(fā)生異常，主要表現(xiàn)在發(fā)生癲癇持續(xù)狀態(tài)后，自發(fā)反復性癲癇發(fā)作出現(xiàn)前，海馬齒狀回下顆粒層細胞增殖能力明顯增強，新生細胞大多分化為神經(jīng)元(顆粒細胞)，它們大多數(shù)向顆粒層遷移，成為成熟顆粒細胞，顆粒細胞產(chǎn)生新的軸突形成MFS。此后在不同的癲癇模型中，均發(fā)現(xiàn)癲癇形成伴有齒狀回神經(jīng)發(fā)生增加和異位顆粒細胞形成MFS，但不同癲癇模型神經(jīng)發(fā)生增加的程度、時序有所不同。癲癇持續(xù)狀態(tài)后，自發(fā)反復

6、性癲癇發(fā)作出現(xiàn)前，增強的海馬齒狀回顆粒細胞為何沒有定向遷移到神經(jīng)元丟失區(qū)并補充和替代丟失的細胞，增殖的海馬齒狀回干細胞的遷移途徑如何，最終定位于何處，目前尚不清楚。 Noggin與骨成形蛋白4(Bone morphogenetic protein4，BMP4)是胚胎期神經(jīng)發(fā)生的重要調(diào)控分子，在原腸胚期共同參與了神經(jīng)板與神經(jīng)管的發(fā)生過程，其中BMP4抑制分離的外胚層細胞向神經(jīng)元分化，促進這些細胞向上皮細胞分化；而Noggin作為

7、BMP4的拮抗結(jié)合蛋白，與BMP4的親和性較高，可阻滯BMP4與其相應的受體結(jié)合，從而抑制BMP受體信號通路，促進這些細胞向神經(jīng)元分化。Noggin對成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous system，CNS)神經(jīng)干細胞的增殖、分化、遷移及維持神經(jīng)元的正常功能有重要的作用。我們還發(fā)現(xiàn)，癲癇持續(xù)狀態(tài)增強的海馬神經(jīng)干細胞增殖與海馬的BMP4的過表達有關。在KA誘發(fā)的癲癇模型，海馬CA3、CA4區(qū)還存在顯著的神經(jīng)元丟失。在KA致海

8、馬損傷后，Noggin在增強的齒狀回顆粒細胞增殖中發(fā)揮何種作用，目前未見相關報導。 為此，本實驗采用KA側(cè)腦室注射(intracerebroventricular，I.C.V.)致海馬損傷模型，采用原位雜交、免疫組化、細胞培養(yǎng)等技術，觀察海馬齒狀回Nestin陽性細胞的分布與BMP4的表達，探討神經(jīng)干細胞的增殖、遷移和分布與癲癇發(fā)病機制的關系；同時觀察成年大鼠在KA側(cè)腦室注射1天到30天內(nèi)，海馬神經(jīng)元丟失情況，海馬齒狀回BrdU

9、標記細胞數(shù)與Noggin表達的關系，為闡明Noggin對海馬齒狀回顆粒細胞增殖與膠質(zhì)增生的作用提供依據(jù)。并通過培養(yǎng)永生化神經(jīng)干細胞系，在體外實驗中進一步證實BMP4/noggin可能對c17.2神經(jīng)干細胞增殖、分化的作用。主要結(jié)果如下： 1.KA側(cè)腦室注射誘發(fā)SE后，注射側(cè)海馬CA3、CA4區(qū)神經(jīng)元丟失明顯并維持在整個實驗觀察階段，沒有細胞數(shù)量的恢復跡象，而注射對側(cè)海馬神經(jīng)元丟失不明顯。 2.KA側(cè)腦室注射致海馬損傷后，

10、成年大鼠海馬齒狀回顆粒下區(qū)Nestin陽性細胞異常增殖和遷移，主要分布在海馬齒狀回門區(qū)，同期觀察到BMP4-mRNA陽性細胞在該部位有較多分布，提示成年大鼠海馬齒狀回顆粒細胞異常增殖和遷移可能與BMP4在該區(qū)的過表達有關。 3.KA側(cè)腦室注射致海馬損傷后，成年大鼠海馬齒狀回顆粒細胞異常增殖，主要分布在齒狀回顆粒下層，同期觀察到Noggin mRNA陽性細胞主要分布于海馬齒狀回的門區(qū)、顆粒下層、CA3、CA1區(qū)；海馬Noggin

11、mRNA陽性細胞在3天時升高，7天時下降。提示成年大鼠海馬齒狀回顆粒下層細胞異常增殖可能與Noggin表達波動有關。 4.體外實驗證明：BMP4能抑制c17.2神經(jīng)干細胞增殖及其向神經(jīng)元分化，noggin通過拮抗BMP4的作用，促進c17.2神經(jīng)干細胞增殖及其向神經(jīng)元分化。 總之，本實驗研究了BMP4/noggin在顳葉癲癇形成過程中在海馬的表達，以及在海馬神經(jīng)干細胞異常增殖及分化中可能所起的作用；并在體外實驗中觀察了B