癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬齒狀回正常遷移成熟新生顆粒細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：
　　顳葉癲癇是成年患者中最為常見的癲癇類型，其中30％-40％患者的癇性發(fā)作不能以現(xiàn)有的藥物進(jìn)行有效的控制。癇性活動(dòng)，特別是癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus，SE)短暫增強(qiáng)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞新生。依據(jù)SE后新生顆粒細(xì)胞胞體遷移的位置可將它們分為正常位置遷移顆粒細(xì)胞和異位遷移顆粒細(xì)胞。大部分異位遷移顆粒細(xì)胞胞體位于門區(qū)，少數(shù)位于分子層。與已經(jīng)存在的顆粒細(xì)胞相比，門區(qū)異位顆粒細(xì)胞帶有底樹突的比例增加、靜息膜電位

2、去極化、部分細(xì)胞具有產(chǎn)生自發(fā)/爆發(fā)性放電的能力以及接受相對較強(qiáng)的興奮性投射，被認(rèn)為有助于癲癇的形成以及癲癇波的擴(kuò)散。
　　活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(activity-regulated cytoskeleton-associatedprotein，Arc)基因是一種即早基因。有充足的證據(jù)表明，無論是在mRNA還是蛋白水平上的Arc表達(dá)改變都可用于反映神經(jīng)元的活動(dòng)強(qiáng)度。
　　本課題應(yīng)用攜帶綠色熒光蛋白(Green Fluore

3、scent Protein，GFP)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體標(biāo)記新生顆粒細(xì)胞，結(jié)合共聚焦顯微成像、腦片膜片鉗記錄以及Arc免疫熒光染色，分析了SE后新生、正常分布的海馬齒狀回顆粒細(xì)胞在發(fā)育成熟后的樹突形態(tài)、樹突棘密度、電生理學(xué)性質(zhì)以及在癲癇發(fā)作間期和癲癇發(fā)作期的細(xì)胞活動(dòng)水平。
　　方法：
　　1.SE的誘導(dǎo)
　　取體重為150-175g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，稱重后，腹腔內(nèi)注射東莨菪堿/特布他林溶液

4、（各2mg/kg）。半小時(shí)后，按340mg/kg的劑量腹腔內(nèi)注射匹羅卡品溶液誘導(dǎo)SE。對照組動(dòng)物注射相應(yīng)容積的生理鹽水。保留Racine癲癇發(fā)作分級(jí)Ⅱ級(jí)或高于Ⅱ級(jí)、發(fā)作時(shí)間持續(xù)2小時(shí)以上的動(dòng)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建
　　將pCMV-VSV-G和pCAG-GFP兩種質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染至Platinum-GP細(xì)胞，分別于48和72小時(shí)后收集上清液，以超速離心分離、濃縮病毒。隨后，以濃縮病毒感染Platinum-E

5、細(xì)胞系構(gòu)建能夠穩(wěn)定產(chǎn)生CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。在對穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，定期收集上清液，以超速離心法濃縮純化病毒載體。將濃縮后的CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體儲(chǔ)藏于-80度保存、備用。
　　3.CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的齒狀回內(nèi)注射
　　在SE誘導(dǎo)后第5天，腹腔內(nèi)注射苯巴比妥(50mg/kg)麻醉大鼠，將動(dòng)物固定于小動(dòng)物腦立體定位儀上。對頭部進(jìn)行消毒后，切開皮膚和皮下組織、暴露顱骨。在前囟后3.2mm、中線

6、右側(cè)2.5mm處，以顱骨鉆鉆孔，去除小塊顱骨、硬腦膜，插入1微升進(jìn)樣針，進(jìn)針深度為2.4mm。將1μl病毒載體，以0.1μl/min的速度注射到海馬齒狀回中。注射完畢后，將針頭停在原位15分鐘以防止溶液沿針孔回流。隨后緩慢退出微量進(jìn)樣針，縫合切口。待大鼠蘇醒后將其轉(zhuǎn)移回鼠籠中。
　　4.經(jīng)心臟灌流固定和海馬組織切片的制作
　　病毒載體腦內(nèi)注射至少10周后，腹腔內(nèi)注射苯巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，以2％多聚甲醛溶液經(jīng)心臟對腦進(jìn)行灌流固定

7、。將取出的腦組織置于2％多聚甲醛溶液中在4℃下固定過夜。經(jīng)梯度沉糖脫水后，以卵白蛋白-明膠-戊二醛混合物包埋含海馬的腦組織塊。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將包埋后的腦組織用振蕩式切片機(jī)薄切至100μm或40μm備用。
　　5.樹突復(fù)雜性以及樹突棘密度的定量分析
　　對厚度為100μm、含有GFP陽性細(xì)胞的切片，先以兔抗GFP抗體進(jìn)行免疫熒光染色加強(qiáng)GFP熒光。使用下列參數(shù)對GFP陽性細(xì)胞進(jìn)行三維序列掃描:20倍物鏡、Zoom為1、掃描間隔

8、為2μm。樹突復(fù)雜性以Sholl法(Sholl analysis)進(jìn)行定量分析。首先以三維序列掃描文件重建細(xì)胞的三維圖像，然后用“ImageJ軟件描畫出除軸突外的整個(gè)胞體和突起的輪廓，用描畫后的細(xì)胞圖像進(jìn)行Sholl分析。所有被分析細(xì)胞均位于齒狀回上錐體片。每只動(dòng)物至少掃描3個(gè)細(xì)胞，以這些細(xì)胞所得數(shù)據(jù)的均值代表單個(gè)動(dòng)物顆粒細(xì)胞樹突復(fù)雜性。對用于樹突棘密度分析的細(xì)胞選擇63X物鏡進(jìn)行三維序列掃描，Zoom和掃描間隔分別為4.0和0.12μ

9、m，掃描部位為位于中分子層的樹突中段和外分子層的樹突末段。對每只動(dòng)物，選中段和末段樹突各9段進(jìn)行掃描和定量分析。以三維序列掃描文件建立樹突三維圖像，用Image J軟件人工計(jì)數(shù)總的樹突棘和蘑菇狀樹突棘。用樹突數(shù)除以相應(yīng)的樹突長度計(jì)算樹突棘密度，表示為樹突棘數(shù)/μm。以9段樹突段所得密度的均值代表個(gè)體動(dòng)物的樹突棘密度。
　　6.腦片膜片鉗記錄
　　逆轉(zhuǎn)錄病毒載體注射至少10周后，用乙醚麻醉動(dòng)物，快速斷頭、取腦，在低溫下制成組織

10、塊并將其固定于切片槽底部。用振蕩切片機(jī)制作厚度為410μm的矢狀腦片。將制備好的腦片用預(yù)先加溫至34.5℃、95％O2/5％CO2-飽和的人工腦脊液孵育30分鐘后，轉(zhuǎn)移到室溫、持續(xù)氧和的人工腦脊液中孵育、備用。將單一腦片置于灌流槽底部，以95％O2/5％CO2-飽和的人工腦脊液持續(xù)灌流腦片。以普通熒光照射（X40水鏡頭）齒狀回部位，尋找GFP陽性細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)GFP陽性細(xì)胞后，即切換到相差模式下觀察，并用CCD相機(jī)將細(xì)胞圖像實(shí)時(shí)顯示在計(jì)算機(jī)

11、屏幕上，然后在室溫下進(jìn)行膜片鉗記錄。記錄的參數(shù)包括自發(fā)和誘發(fā)放電、微小興奮性突觸后電流(mEPSC)和微小抑制性突觸后電流(mIPSC)。
　　7.戊四氮(PTZ)誘導(dǎo)急性癲癇發(fā)作以及Arc的免疫熒光強(qiáng)度比較
　　逆轉(zhuǎn)錄病毒載體注射至少10周后，腹腔內(nèi)注射PTZ(20mg/kg)誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，對照組動(dòng)物給予等體積/體重的生理鹽水注射。癲癇發(fā)作15分鐘后，腹腔內(nèi)注射地西泮(5mg/kg)予以終止。地西泮注射2小時(shí)后，以2％多聚

12、甲醛經(jīng)心臟對腦進(jìn)行灌流固定、取腦。隨后，將腦組織在同樣濃度的多聚甲醛溶液中固定過夜后，梯度沉糖、脫水，用振蕩切片機(jī)制作厚度為40μm的冠狀面腦片。用PBS清洗后，將腦片置于封閉液中在4℃下封閉2.5小時(shí)。隨后將腦片轉(zhuǎn)移至兔抗Arc抗體溶液（用封閉液稀釋1000倍）中4℃孵育過夜。第二天，用PBS清洗后，將腦片置于Alexa Flour488標(biāo)識(shí)的驢抗兔二抗溶液中在4℃下孵育2.5小時(shí)。洗片后，將腦片置于載玻片上，用含有75％甘油的PBS

13、溶液封片。
　　對含有GFP陽性新生細(xì)胞、經(jīng)Arc免疫熒光染色后的腦片以共聚焦顯微鏡在40倍鏡下進(jìn)行層掃描(Zoom=1.0)。應(yīng)用ImageJ軟件分別對GFP陽性細(xì)胞胞體和GFP陽性細(xì)胞周圍10個(gè)GFP陰性顆粒細(xì)胞胞體的Arc熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定。計(jì)算同一張切片中GFP陽性細(xì)胞Arc熒光強(qiáng)度值和周圍GFP陰性細(xì)胞Arc熒光強(qiáng)度均值的比值，以此比值來評(píng)價(jià)成熟的新生顆粒細(xì)胞和已經(jīng)存在顆粒細(xì)胞的活動(dòng)強(qiáng)度。
　　結(jié)果：
　　1.

14、CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體標(biāo)識(shí)新生顆粒細(xì)胞的有效性
　　載體注射10周后，在對照組動(dòng)物和癲癇模型組動(dòng)物都可觀察到胞體位于顆粒細(xì)胞層、樹突形態(tài)完整、樹突末梢到達(dá)外分子層的表達(dá)GFP的新生顆粒細(xì)胞。在癲癇模型組動(dòng)物，GFP陽性細(xì)胞較為稀疏，部分GFP陽性細(xì)胞帶有向門區(qū)走行的底樹突。
　　2.癲癇組與對照組動(dòng)物新生顆粒細(xì)胞成熟后樹突復(fù)雜性和樹突棘密度的比較
　　癲癇組與對照組動(dòng)物相比，兩組動(dòng)物新生顆粒細(xì)胞的樹突復(fù)雜性沒有顯

15、著性差異。樹突棘定量分析發(fā)現(xiàn)在中段樹突，兩組動(dòng)物的總樹突棘和蘑菇狀樹突棘密度相似，但SE組動(dòng)物末段樹突的蘑菇狀樹突棘密度較對照動(dòng)物顯著增加。
　　3.癲癇組與對照組動(dòng)物新生顆粒細(xì)胞成熟后電生理學(xué)性質(zhì)的比較
　　癲癇組動(dòng)物和對照組動(dòng)物分別有17.6％(3/17)和11.76％(2/17)的成熟顆粒細(xì)胞出現(xiàn)短暫的自發(fā)放電(P＞1.0)。對照組動(dòng)物和癲癇組動(dòng)物成熟顆粒細(xì)胞的靜息膜電位水平分別為-76.0±1.1mV(n=6)和-7

16、5.8mV±0.9mV(n=6)，兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞內(nèi)注射電流誘發(fā)的動(dòng)作電位參數(shù)包括動(dòng)作電位閾值、幅度、寬度、后去極化電位的幅度和面積在兩組之間也沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在-70mV，兩組動(dòng)物的mIPSC無論在頻率、幅度、上升時(shí)間、衰減時(shí)間以及曲線下面積等方面均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但與對照組動(dòng)物相比，癲癇組成熟顆粒細(xì)胞的mEPSC的幅度較對照組小，而且頻率也有降低的趨勢。
　　4.癲癇組與對照組動(dòng)物新生顆粒細(xì)胞成熟后在癲癇發(fā)

17、作間期和癲癇活動(dòng)期細(xì)胞活動(dòng)強(qiáng)度的比較
　　1)在未經(jīng)PTZ誘導(dǎo)的對照動(dòng)物，Arc整體表達(dá)水平較低，但成熟后的正常遷移新生顆粒細(xì)胞與周圍顆粒細(xì)胞相比，Arc表達(dá)量稍高。2）未經(jīng)PTZ誘導(dǎo)的癲癇組動(dòng)物，成熟的癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞與周圍已經(jīng)存在顆粒細(xì)胞相比，Arc表達(dá)量極為接近。3）在經(jīng)PTZ誘導(dǎo)的對照組動(dòng)物，癇性活動(dòng)顯著增加Arc蛋白的表達(dá)，但與已存在顆粒細(xì)胞相比，成熟后的新生顆粒細(xì)胞Arc表達(dá)量偏低。在給予PTZ誘導(dǎo)的有自發(fā)癲

18、癇的動(dòng)物，這一趨勢沒有出現(xiàn)顯著改變。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，無論是在癲癇發(fā)作期還是發(fā)作間期，成熟的癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞的活動(dòng)度與周圍顆粒細(xì)胞相比并沒有差異。
　　結(jié)論：
　　癲癇持續(xù)狀態(tài)后正常遷移的新生顆粒細(xì)胞成熟后與生理?xiàng)l件下新生的同齡顆粒細(xì)胞相比，終末段樹突蘑菇狀棘密度較高，但微小興奮性突觸后電流的幅度較低，其它參數(shù)包括樹突復(fù)雜性、抑制性突觸傳遞以及癲癇發(fā)作間期和癲癇發(fā)作期的細(xì)胞活動(dòng)性均無顯著性差異。以上結(jié)果提示癲癇持續(xù)狀態(tài)