大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬新生顆粒細(xì)胞樹(shù)突的發(fā)育特征.pdf

1、研究背景和目的：
　　哺乳類動(dòng)物海馬齒狀回是終生具有產(chǎn)生顆粒細(xì)胞能力的腦結(jié)構(gòu)。位于齒狀回顆粒下區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞在受到刺激后分化、發(fā)育為成熟顆粒細(xì)胞，同時(shí)整合至齒狀回神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。嚙齒類動(dòng)物成年新生顆粒細(xì)胞在新生后在經(jīng)歷不同發(fā)育階段后，約需2個(gè)月成為與已經(jīng)存在顆粒細(xì)胞在形態(tài)、電生理學(xué)性質(zhì)和突觸聯(lián)系相似的成熟顆粒細(xì)胞。成年顆粒細(xì)胞新生與海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)、記憶形成以及情緒調(diào)節(jié)密切相關(guān)。許多生理、病理因素可以顯著改變成年海馬齒狀回神經(jīng)新生。癲癇持

2、續(xù)狀態(tài)后海馬齒狀回神經(jīng)新生出現(xiàn)短暫增強(qiáng)。迄今，在癲癇發(fā)生中神經(jīng)新生增強(qiáng)的意義尚存爭(zhēng)議。借助于逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的綠色熒光蛋白(GFP)基因?qū)π律w粒細(xì)胞的標(biāo)識(shí)以及共聚焦成像，本課題研究了匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中樹(shù)突形態(tài)、樹(shù)突棘密度和細(xì)胞活性的變化。
　　材料和方法：
　　材料:
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性SD大鼠（140-170 g，6-7周齡）。
　　方法:
　　1.癲癇持續(xù)狀態(tài)的誘導(dǎo)以及

3、齒狀回內(nèi)注射逆轉(zhuǎn)錄病毒載體癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)以腹腔內(nèi)注射匹羅卡品誘導(dǎo)。選取對(duì)Racine氏SE分級(jí)Ⅱ級(jí)或以上、發(fā)作時(shí)間長(zhǎng)于2小時(shí)的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以腹腔內(nèi)生理鹽水注射的同齡動(dòng)物作為對(duì)照。CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在SE誘導(dǎo)第5天以立體定向技術(shù)注入海馬齒狀回。
　　2.灌流和切片制作
　　在CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體齒狀回內(nèi)注射5天、28天或至少70天后，腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物后，用4％多聚甲醛經(jīng)心臟對(duì)腦進(jìn)行灌流

4、固定。取腦后，以4％多聚甲醛對(duì)腦進(jìn)行后固定過(guò)夜。在以10％-15％-20％蔗糖磷酸緩沖液對(duì)樣本進(jìn)行沉糖處理后，以明膠-白蛋白-戊二醛混合液包埋組織塊，經(jīng)振動(dòng)切片機(jī)制作厚度為100μ m或40μ m的海馬冠狀切片。
　　3.免疫熒光染色
　　GFP免疫熒光染色:在普通熒光顯微鏡下，挑選出含有GFP細(xì)胞的100μ m厚切片。對(duì)腦片進(jìn)行免疫熒光染色，所用一抗和二抗分別山羊抗GFP以及和Alexa fluor488結(jié)合的驢抗山羊Ig

5、G。Arc免疫熒光染色:在普通熒光顯微鏡下，挑選出含有GFP細(xì)胞的40μm厚切片。對(duì)腦片進(jìn)行免疫熒光染色，所用一抗和二抗分別為兔抗Arc以及和Alexa fluor568結(jié)合的驢抗兔IgG。NeuN免疫熒光染色:在普通熒光顯微鏡下，挑選出含有GFP陽(yáng)性細(xì)胞(GFP+)的40μm厚切片。對(duì)腦片進(jìn)行免疫熒光染色，所用一抗和二抗分別為鼠抗NeuN以及和Alexa fluor568結(jié)合的驢抗鼠IgG。
　　4.樹(shù)突復(fù)雜性分析
　　對(duì)

6、分布于齒狀回上支、少與其它細(xì)胞重疊、樹(shù)突分支基本完整的細(xì)胞進(jìn)行z軸連續(xù)序列掃描，以此獲取神經(jīng)元胞體以及樹(shù)突的3D圖片。應(yīng)用ZEN軟件對(duì)該3D圖片進(jìn)行z軸最大密度投影。在Image J中打開(kāi)投影后細(xì)胞圖像，手動(dòng)描繪出細(xì)胞胞體和樹(shù)突。樹(shù)突復(fù)雜程度以Sholl法進(jìn)行分析:以神經(jīng)元胞體中心為圓心，每隔25μ m劃一同心圓。樹(shù)突與同心圓交點(diǎn)的數(shù)目代表樹(shù)突復(fù)雜性。
　　5.樹(shù)突棘密度分析
　　對(duì)于位于齒狀回上支的每一個(gè)GFP+顆粒細(xì)胞，

7、隨機(jī)選取中段和末段樹(shù)突各3段進(jìn)行高倍鏡下的z軸系列掃描，建立各段樹(shù)突的3D圖像，在Image J中對(duì)樹(shù)突棘進(jìn)行計(jì)數(shù)。樹(shù)突棘密度以樹(shù)突棘數(shù)目除以樹(shù)突長(zhǎng)度計(jì)算。
　　6.Arc熒光強(qiáng)度分析
　　共聚焦拍攝GFP陽(yáng)性以及周圍GFP陰性細(xì)胞(GFP-) Arc熒光圖像后，應(yīng)用Image J軟件對(duì)GFP陽(yáng)性顆粒細(xì)胞Arc熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。隨機(jī)選取同張照片外分子層的10個(gè)顆粒細(xì)胞，測(cè)其Arc熒光強(qiáng)度，計(jì)算這些GFP陰性細(xì)胞的平均Arc熒

8、光強(qiáng)度。GFP+神經(jīng)元的活動(dòng)水平以GFP+神經(jīng)元的Arc熒光強(qiáng)度值與GFP-細(xì)胞Arc熒光強(qiáng)度均值的比值來(lái)表示。
　　7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
　　定量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以Grahpad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。P≤0.05，考慮為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.正常生理?xiàng)l件下和癲癇病理?xiàng)l件下，大鼠海馬齒狀回均有成年后神經(jīng)新生現(xiàn)象，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的GFP標(biāo)識(shí)方法標(biāo)記的細(xì)胞類型有顆粒細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞。GFP+顆粒細(xì)胞分

9、布于顆粒細(xì)胞層內(nèi)1/3，GFP在胞體、軸突、樹(shù)突均有表達(dá)。
　　2.與對(duì)照組同齡顆粒細(xì)胞相比，癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞在未成熟階段(4周齡)樹(shù)突復(fù)雜度更高，而在成熟后（10周齡），樹(shù)突復(fù)雜度沒(méi)有差異。
　　3.與對(duì)照組同齡顆粒細(xì)胞相比，癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞在未成熟階段(4周齡)位于中分子層的樹(shù)突棘密度（對(duì)照組:1.96±0.05個(gè)/μm，n=5;癲癇組:2.23±0.04個(gè)/μm，n=4）和蘑菇狀樹(shù)突棘密度（對(duì)照組:

10、0.06±0.002個(gè)/μm， n=5;癲癇組:0.07±0.002個(gè)/μm，n=4）更高。而癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞成熟后（10周齡）與對(duì)照組同齡顆粒細(xì)胞相比，位于外分子層的蘑菇狀樹(shù)突棘密度（對(duì)照組:0.10±0.007個(gè)/μm，n=6;癲癇組:0.13±0.01個(gè)/μm，n=6）更高。
　　4.對(duì)照組和癲癇組未成熟GFP+細(xì)胞（4周齡）Arc的熒光強(qiáng)度與周圍成熟GFP-顆粒細(xì)胞Arc的熒光強(qiáng)度平均值的比值分別為（1.54±0

11、.13，n=3）和(1.45±0.17，n=7)，活動(dòng)水平高于周圍成熟顆粒細(xì)胞。對(duì)照組和癲癇組成熟GFP+細(xì)胞（10周齡）Arc的熒光強(qiáng)度與周圍已成熟GFP-顆粒細(xì)胞Arc的熒光強(qiáng)度平均值的比值分別為（1.18±0.10，n=6）和（0.98±0.04，n=6），活動(dòng)水平與周圍成熟顆粒細(xì)胞相近。
　　結(jié)論:
　　與自然狀態(tài)下新生的顆粒細(xì)胞相比，癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)樹(shù)突和細(xì)胞活動(dòng)度的發(fā)育性改變。癲癇持續(xù)狀態(tài)后4周齡新