寧夏枸杞內(nèi)生真菌多樣性及其生防作用評價.pdf

1、枸杞（Lycium barbarum L.）是西北地區(qū)獨(dú)特的沙生藥用植物，國內(nèi)外對枸杞的研究多集中在對其化學(xué)成分、抗逆性、抗氧化性及其相關(guān)功能產(chǎn)品的研究上，而對其內(nèi)生真菌研究較少。本研究以寧夏枸杞為研究對象，在摸清其內(nèi)生真菌多樣性及分布基礎(chǔ)上，以植物病原真菌為靶標(biāo)菌，篩選高活性拮抗菌株，探究其抑菌、抗生和重寄生等生防潛力;篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶的菌株探究其產(chǎn)酶條件;通過內(nèi)生真菌對宿主的侵染定殖，測定內(nèi)生真菌對枸杞植株生長、

2、抗病和防御酶活性的影響，初步揭示其抗病作用機(jī)制。研究結(jié)果如下:
　　1、采用組織分離法對健康枸杞植株進(jìn)行內(nèi)生真菌分離，利用形態(tài)特征和rDNA-ITS序列分析對菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:7個寧夏枸杞品種21份樣品中共分離得到內(nèi)生真菌363株，這些菌株分屬14個屬，其中鏈格孢屬（Alternaria）、梭孢殼屬（Thielavia）和曲霉屬（Aspergillus）為優(yōu)勢屬，分別占分離菌株數(shù)的46％、14％和13％。枸杞植株各器官都有內(nèi)

3、生真菌分布，莖部內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)最大，為0.88，且果與莖部的相似性系數(shù)最大。內(nèi)生真菌的分離率和分布頻率說明不同枸杞品種間內(nèi)生真菌分布存在差異。
　　2、以枸杞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和4種常見植物病原真菌為靶標(biāo)菌，采用皿內(nèi)對峙和孢子萌發(fā)抑制試驗，測試了121株枸杞內(nèi)生真菌的拮抗作用。結(jié)果表明，菌株NQ3GF1、NQ7GF3和NQ8YF3具有高拮抗活性，其中NQ7GF3的拮抗活性最高

4、，抑菌帶寬度達(dá)9.96 mm;菌株NQ3GF1與NQ4YF11具有一定廣譜抗菌活性;菌株NQ3GF1和NQ7GF3無菌絲發(fā)酵液在濃度大于25％時，對枸杞炭疽病菌孢子萌發(fā)有較好的抑制效果，6h后的抑制率均在75％以上;顯微觀察結(jié)果表明，菌株NQ3GF1與枸杞炭疽病菌有纏繞、穿透等重寄生現(xiàn)象;并能成功定殖于枸杞根部。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，菌株NQ3GF1、NQ7GF3和NQ8YF3分別為細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissi

5、ma）、夏孢枝孢菌（Cladosporium uredinicola）和蓋姆斯炭角菌（Coniolariellagamsii）。
　　3、采用透明圈法，對6株高活性枸杞拮抗內(nèi)生真菌菌株進(jìn)行了產(chǎn)胞外幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶篩選，獲得2株同時產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶的菌株，其中菌株NQ3GF1產(chǎn)酶活性最高，透明圈半徑達(dá)6mm以上。用牛津杯法測定NQ3GF1粗酶液的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)2種粗酶液對枸杞炭疽病菌（C.gloeosp

6、orioides Pena.）的抑菌帶寬度均大于10 mm;對菌株NQ3GF1產(chǎn)酶條件的研究結(jié)果表明，當(dāng)碳源（茯苓粉或膠體幾丁質(zhì)）為0.6％，氮源為蛋白胨，初始pH值在6～8之間，
　　25℃振蕩培養(yǎng)6d時，培養(yǎng)液中幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性較高。
　　4、利用顯微觀察和回接試驗研究了枸杞內(nèi)生真菌NQ3GF1在枸杞根莖部的侵染定殖情況及對宿主生長和防御酶活性的影響。結(jié)果表明，在枸杞接種24～48 h時菌絲在根表形成網(wǎng)

7、狀結(jié)構(gòu)，72 h后菌絲能穿透表皮侵入至根髓部;濃度低于30％的滅活菌絲發(fā)酵液和濃度低于50％的活菌發(fā)酵液對枸杞組培苗、盆栽苗生長具有促進(jìn)作用，當(dāng)濃度高于此濃度時，滅活菌絲及活菌發(fā)酵液均抑制植物的生長;內(nèi)生真菌NQ3GF1在宿主體內(nèi)定殖后，提高了枸杞苗的抗病性，對枸杞炭疽病防效達(dá)到75.27％，是對照組枸杞苗的3倍;菌株NQ3GF1發(fā)酵液在接種后3～12 d，各濃度處理組PAL酶活性較對照組活性增高，分別在第9d和第6d達(dá)到最高，為22.