SLA-DOB基因的克隆、原核表達(dá)及多態(tài)性研究.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)指集中于某一染色體、編碼與免疫應(yīng)答直接相關(guān)的一類細(xì)胞膜糖蛋白基因群。其功能不僅限于移植排斥反應(yīng)，它還與機(jī)體對(duì)外源性抗原的免疫應(yīng)答之間存在關(guān)聯(lián)。近年來(lái)，基于MHC基因在器官移植和免疫應(yīng)答上扮演的重要角色，人們?cè)谌?、鼠、綿羊、牛、犬等物種上進(jìn)行了大量的研究。豬SLA-DOB基因是參與SLAⅡ類抗原遞呈的一個(gè)重要功能基因，但在國(guó)內(nèi)暫沒有看到對(duì)該基因的相

2、關(guān)研究報(bào)道。有鑒于此，本文以巴馬小型豬、五指山小型豬、滇南小耳豬、合作豬、甘孜藏豬、荷包豬六個(gè)品種共137頭豬的耳組織樣以及一頭巴馬小型豬的內(nèi)臟器官為材料，運(yùn)用生物信息學(xué)手段、RT-PCR、原核表達(dá)及SSCP-PCR結(jié)合測(cè)序等方法對(duì)SLA-DOB基因進(jìn)行了研究，主要包括對(duì)該基因序列的獲取、特性分析預(yù)測(cè)、組織表達(dá)及多態(tài)性等方面，為豬免疫應(yīng)答抗原遞呈和相關(guān)基因多態(tài)性信息的后續(xù)研究提供一些有益的參考。主要研究結(jié)果如下： 1.以人HLA

3、-DOB基因cDNA序列為信息探針，對(duì)豬EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源檢索篩選，克隆了豬SLA-DOB1基因的cDNA序列，片段全長(zhǎng)897bp。通過(guò)NCBI的ORFfinder服務(wù)器對(duì)所獲得的cDNA序列進(jìn)行開放閱讀框架(ORF)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其開放閱讀框架推測(cè)編碼277個(gè)氨基酸。為了驗(yàn)證電子克隆序列的正確性，在其起始密碼子區(qū)域和終止密碼區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)RT-PCR進(jìn)行克隆、序列分析驗(yàn)證，結(jié)果表明與電子克隆序列完全一致(GenBank登錄號(hào)為

4、DQ333334)。通過(guò)序列同源比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)克隆到的序列與其它物種DOB基因具有很高的同源性。應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對(duì)SLA-DOB1基因編碼氨基酸進(jìn)行蛋白質(zhì)基本性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示SLA-DOB1分子是一種具有信號(hào)肽序列，靠近N端末端存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的MHCⅡ類β分子前體蛋白。多序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SLA-DOB1與小鼠、牛、兔子、綿羊、犬、黑猩猩、人的DOB核酸序列的同源性分別為71％、77％、69％、79％、

5、76％、77％、78％；與小鼠、牛、綿羊、犬、黑猩猩、人的DOB氨基酸序列的同源性分別為67％、76％、80％、78％、67％、76％。構(gòu)建SLA-DOB1基因的分子進(jìn)化樹進(jìn)一步揭示了豬與其它哺乳動(dòng)物的進(jìn)化關(guān)系。 2.本研究構(gòu)建了SLA-DOB1基因全編碼序列的原核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行了表達(dá)研究。將克隆在pMD18-T載體上的SLA-DOB1基因全編碼序列(834bp)插入原核表達(dá)載體pMAL-C2X，得到重組質(zhì)粒pMAL-C2X-

6、DOB1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1(表達(dá)菌株)，IPTG誘導(dǎo)裂解菌體作SDS-PAGE分析，粗略得到融合表達(dá)蛋白特異條帶，該表達(dá)條帶的大小為75.8KDa(SLA-DOB1蛋白質(zhì)為32.3KDa，菌蛋白為42.5KDa)。 3.巢式PCR檢測(cè)SLA-DOB1基因在心、肝、脾、回腸、腎、胸腺、淋巴結(jié)中表達(dá)。其中，該基因在脾臟、胸腺以及淋巴結(jié)中高度表達(dá)，其次在心臟、回腸、腎臟和肝臟中有表達(dá)，而在肌肉中沒有任何表達(dá)。 4.通過(guò)比對(duì)出

7、的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)了三對(duì)引物擴(kuò)增出SLA-DOB的內(nèi)含子1、2、3三個(gè)DNA片段，長(zhǎng)度分別為571bp、663bp和804bp。根據(jù)內(nèi)含子序列又設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物擴(kuò)增出SLA-DOB的外顯子2、3區(qū)域，長(zhǎng)度分別為291bp和334bp。對(duì)DOB基因的外顯子2、3通過(guò)SSCP的方法對(duì)6品種豬群共137個(gè)體進(jìn)行了群體多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)SLA-DOB第2外顯子高度保守，而外顯子3基于個(gè)體PCR-SSCP和菌落PCR-SSCP鑒別了10種等位基因，通過(guò)