斑馬魚intelectin基因zITLN1、zITLN2、zITLN3的克隆與功能研究.pdf

1、免疫系統(tǒng)最根本的作用是識別“自己”和“非己”，先天性免疫是免疫的第一道防線，先天性免疫系統(tǒng)對于“自己”和“非己”的識別主要是由一系列基因編碼受體來完成的，這些受體被稱為模式識別受體(PRRs)。病原分子共有的成分，比如細胞壁的多糖以及RNA病毒的雙鏈等，能夠被PRRs識別，并引發(fā)一系列的信號通路來對各種免疫相關基因的表達進行調(diào)控，從而達到清除病原體的效果。凝集素(Lectin)不僅能夠直接參與免疫防御，更是一種重要的模式識別分子，在先天

2、性免疫應答中發(fā)揮重要作用。
　　腸道凝集素(Intelectin，ITLN)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種能夠結合β-呋喃半乳糖的凝集素，在多種生命活動中發(fā)揮重要作用，并且與人類的很多疾病如哮喘、心臟病、腸炎、慢性阻塞性肺氣腫甚至癌癥都有一定關系。目前關于腸道凝集素的研究主要集中在哺乳動物、兩棲動物、硬骨魚、文昌魚和海鞘當中。雖然不同物種的ITLN序列高度保守，但是它們在表達模式和功能上也存在一定差異。鑒于ITLN在模式識別中的重要功能，研

3、究其模式識別的機制顯得尤為重要。斑馬魚作為一種重要的模式生物，具有較為完整的先天免疫和后天免疫系統(tǒng)，同時其免疫系統(tǒng)在分子和細胞水平上都與哺乳動物相似度很高。所以我們選擇了斑馬魚的腸道凝集素(zebrafish Intelectin，zITLN)來研究其模式識別的機制。
　　我們首先利用生物信息學的技術手段，對斑馬魚Intelectin的進化地位進行分析，選擇了處于三個不同分支上的斑馬魚Intelectin:zITLN1、zITLN

4、2和zITLN3來進行研究。我們對這3個zITLN進行了克隆，利用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)的方法對成體斑馬魚的zITLN1、zITLN2和zITLN3的組織分布進行了探索，實驗結果表明3個zITLN在腸道、眼球、皮膚、鰓、肝臟以及尾鰭中均有表達，但表達模式及表達量不盡相同:zITLN1和zITLN2主要集中在腸道中表達，肝臟中表達量很低，而zITLN3與前兩者不同，主要集中在肝臟中表達，當然其在腸道中的表達量也相

5、對較高。我們同樣利用Real-time PCR的方法檢測了金黃色葡萄球菌對斑馬魚Intelectin表達的調(diào)控，結果表明金黃色葡萄球菌可以引起zITLN1、zITLN2和zITLN3的表達上調(diào)，但是程度與模式不盡相同:zITLN1和zITLN3對于金黃色葡萄球菌的刺激反應更為靈敏，在注射金黃色葡萄球菌之后的4小時就出現(xiàn)了表達的上調(diào)，8小時達到最高值，而zITLN2在前8小時中的上調(diào)很緩慢，直到10小時突然達到峰值。我們利用大腸桿菌表達系

6、統(tǒng)對3種ITLN進行了表達，并對其表達產(chǎn)物進行純化。細菌凝集實驗中，熒光鏡檢顯示，鈣離子存在時，zITLN1、zITLN2和zITLN3重組蛋白均可以不同程度的引起FITC標記的細菌的凝集，zITLN1和zITLN3一樣凝集金黃色葡萄球菌的能力要強于凝集大腸桿菌的能力，而zITLN2對于兩種細菌的凝集卻沒有表現(xiàn)出明顯差異。Western blotting結果顯示3個ITLN都可以結合細菌，zITLN1和zITLN3一樣結合金黃色葡萄球菌

7、的能力要強于結合大腸桿菌的能力，但是zITLN2對于兩種細菌的結合沒有表現(xiàn)出明顯差異。ELISA定量分析的結果表明zITLN1和zITLN3對PGN的親和性要高于LPS，而zITLN2在多糖結合上沒有明顯的偏向性?？偲饋碚f，zITLN2結合多糖的能力要高于zITLN1和zITLN3。上述結果表明:zITLN1、zITLN2和zITLN3可以識別細菌細胞壁的主要成分，從而能結合細菌并引發(fā)細菌的凝集。但是它們的識別和結合效應以及后續(xù)的作用機

8、制可能不同。為了進一步探究intelectin基因內(nèi)在的糖識別結構域，我們構建了zITLN1-D5、zITLN2-D5和zITLN3-D5三個缺失突變體，通過細菌凝集、細菌結合和多糖結合的實驗在斑馬魚當中首次發(fā)現(xiàn)zITLN序列C末端100個左右的氨基酸(D5)在細菌凝集、細菌結合和糖結合方面的功能與其全長并無明顯差異。說明ITLN中負責多糖識別的是D5結構域而并非此前有過報道的FReD結構域。同時我們對D5結構域中負責鈣離子結合的位點進

9、行分析研究，通過細菌凝集、細菌結合和多糖結合的實驗驗證了三個可能的與鈣離子結合相關的位點（G53-G54-G55）。我們進一步將zITLN1和zITLN2的D5結構域進行互換，構建了zITLN1-2D5和zITLN2-1 D5兩個嵌合體重組蛋白，對它們的凝集素功能進行研究，研究發(fā)現(xiàn)兩個嵌合體重組蛋白的凝集素功能都是與其所包含的D5結構域的功能相一致，進一步說明D5是zITLN當中重要的糖識別功能域，D5結構域決定了全長的糖結合能力。

10、r>　　另外，我們利用ELISA技術檢測到zITLN1、zITLN2和zITLN3重組蛋白都可以與小牛乳鐵蛋白進行結合，但是zITLN1、zITLN2和zITLN3重組蛋白并不具備殺菌功能。
　　以上對斑馬魚3個ITLN結合多糖從而結合細菌、凝集細菌的研究能夠加深我們對ITLN基因參與細菌感染引起的免疫防御機制的理解，而對于糖識別結構域的研究初步探索了斑馬魚腸道凝集素糖識別的機制，為intelectin基因在其他病理和生理過程中的