斑馬魚becn1基因的功能研究.pdf

1、細胞自噬是細胞內(nèi)重要的降解途徑之一，細胞中雙層膜結構包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體（autophagosome），然后與溶酶體（lysosome）融合形成自噬溶酶體（autophagolysosome），降解其所包裹的內(nèi)容物，產(chǎn)生氨基酸等生物小分子，并被細胞重新利用，以實現(xiàn)細胞器的更新和細胞穩(wěn)態(tài)。自噬在應對細胞饑餓，維持細胞質(zhì)量、能量平衡，抑制腫瘤發(fā)生，調(diào)控機體免疫等過程中都發(fā)揮著重要的功能。近年來在小鼠中，許多

2、自噬相關基因系統(tǒng)性和組織特異性敲除實驗證明了自噬對胚胎著床前的發(fā)育、胚胎發(fā)生到新生個體的存活都必不可少。越來越多的研究結果表明自噬參與肝臟中的物質(zhì)代謝，也在許多肝臟疾病包括脂肪肝和肝癌的發(fā)生都發(fā)揮著重要的作用。
　　Beclin1基因也稱BECN1基因，是酵母自噬相關基因ATG6的哺乳動物同源基因，該基因位于人染色體17q21，具有12個外顯子，并且廣泛表達于人類正常組織，是哺乳動物自噬發(fā)生的必需基因。Beclin1蛋白結構與其功

3、能在多種物種中都高度保守，Beclin1蛋白有四個重要的結構域：BH3(Bcl-2 homolog3)結構域、卷曲螺旋結構域(coiled-coil domain/CCD)、進化保守結構域(evolutionarily conserved domain/ECD)和一個核輸出結構域(NES)，Beclin1通過這些結構域招募其它多個自噬相關蛋白并定位于吞噬泡，形成多蛋白復合體，以此來調(diào)控哺乳動物自噬小體的形成與成熟。
　　斑馬魚(D

4、anio rerio)是一種亞熱帶小型魚類，具有魚體小、易于飼養(yǎng)、發(fā)育快速、性成熟期短、體外受精、胚胎體外發(fā)育并且透明，再生能力強等特點，是研究器官發(fā)育與再生的常用模式動物。人們發(fā)現(xiàn)許多自噬相關基因如atg1，atg3，atg4，atg5，becn1，atg7，atg9，ambra1，atg12，atg14和atg16在斑馬魚中都存在同源基因，其蛋白結構與人類高度相似，而斑馬魚的優(yōu)點也使其成為研究自噬功能和機制的良好模式生物。近年來一些

5、工作利用MOs在斑馬魚中研究自噬，希望能揭示自噬在斑馬魚發(fā)育和器官再生中的作用，以及探究自噬在病菌感染防御，細胞先天性免疫和獲得性免疫中的作用。2012年以來TALEN和CRISPR/Cas9基因敲除技術在斑馬魚中成功的運用，極大地豐富了斑馬魚的研究手段和研究領域，也成為斑馬魚中研究自噬的有力工具。
　　本研究利用CRISPR/Cas9技術在斑馬魚中敲除自噬相關基因becn1，構建突變體，用來探究becn1在斑馬魚胚胎發(fā)育中的功能

6、，特別是對斑馬魚肝臟發(fā)育及功能的影響。
　　我們運用CRISPR/Cas9技術在斑馬魚中成功地敲除了becn1基因，獲得了穩(wěn)定遺傳的突變體。6dpf之前，becn1突變體形態(tài)發(fā)育與野生型沒有明顯區(qū)別，這表明becn1對斑馬魚胚胎期的發(fā)育可能不是必需的，盡管不能排除突變對特定細胞分化和生理環(huán)境存在影響。在7～8dpf時，becn1突變體肝臟明顯腫大，比野生型大1.5～2倍左右，pH3免疫染色實驗表明肝臟細胞大量增殖。突變體肝臟中P6

7、2蛋白，泛素化蛋白以及蛋白聚集體大量增加，線粒體特異性標記物Cox4i1蛋白水平也明顯升高，說明細胞中自噬的形成被阻斷，導致蛋白聚集體和線粒體積累。Western blot的結果表明becn1突變體中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的相關蛋白Chop，Bip，p-Eif2都明顯增加，并導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。在9～10dpf，becn1突變體死亡。同時，我們也利用CRISPR/Cas9技術在斑馬魚中成功地構建了自噬相關基因atg7和atg5的突變體，初步的結果表明這

8、些突變體的胚胎發(fā)育基本正常，但是在出生后13dpf到26dpf都基本死亡，其死亡原因以及死亡前組織細胞以及器官的變化還需進一步研究。
　　本研究通過CRISPR/Cas9技術在斑馬魚中成功構建了三個自噬相關基因becn1，atg5和atg7穩(wěn)定遺傳的突變體，由于斑馬魚體外受精，發(fā)育快速的特點，避免了哺乳動物中系統(tǒng)性敲除這些基因?qū)е屡咛グl(fā)育早期或出生不久便死亡的結果，為進一步研究自噬在發(fā)育、維持細胞分化、細胞生理功能以及對腫瘤發(fā)生影