泡沫碳化硅對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的體外研究.pdf

1、目的：
　　 前期的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)動(dòng)物植入實(shí)驗(yàn)表明:中科院金屬研究所利用“高分子熱解結(jié)合可控熔滲反應(yīng)燒結(jié)技術(shù)”制備的泡沫碳化硅具備成為骨缺損修復(fù)材料的基本條件。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察研究泡沫碳化硅對(duì)取自大鼠胎鼠顱骨的原代成骨細(xì)胞的增殖和分化的影響,進(jìn)一步探討泡沫碳化硅作為骨缺損修復(fù)材料的可行性。
　　 方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)組為泡沫碳化硅(Silicon carbide,SiC),對(duì)照組為多孔羥基磷灰石(Hydro

2、xyapatite,HA)。
　　 2、大鼠胎鼠顱骨成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定。
　　 3、掃描電鏡觀察兩種材料表面原代成骨細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)狀況。
　　 4、 MTT比色法檢測(cè)兩種材料上活細(xì)胞的數(shù)量和功能狀態(tài),分析兩種材料對(duì)原代成骨細(xì)胞的毒性。
　　 5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種材料上原代成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期各階段的狀況,計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù),分析兩種材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　 6、檢測(cè)兩種材料上原代成骨細(xì)胞的

3、堿性磷酸酶含量,分析兩種材料對(duì)細(xì)胞分化的影響。
　　 7、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)兩種材料上原代成骨細(xì)胞的骨鈣素和核心結(jié)合因子a1的mRNA,分析兩種材料對(duì)細(xì)胞分化的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、原代成骨細(xì)胞培養(yǎng):相差顯微鏡下可見(jiàn),培養(yǎng)5d的原代成骨細(xì)胞以不規(guī)則形、長(zhǎng)梭形、三角形為主,相鄰細(xì)胞彼此貼靠,細(xì)胞內(nèi)及表面開(kāi)始出現(xiàn)黑色點(diǎn)狀分泌物,部分區(qū)域出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)以及輻射生長(zhǎng)的現(xiàn)象。經(jīng)堿性磷酸酶染色,成骨細(xì)胞的細(xì)胞

4、質(zhì)呈深藍(lán)色;茜素紅將細(xì)胞間分泌的鈣結(jié)節(jié)染成紅色;Ⅰ型膠原免疫熒光染色,細(xì)胞質(zhì)染色發(fā)出紅光,細(xì)胞核用DAPI染色后發(fā)出藍(lán)光。
　　 2、掃描電鏡結(jié)果:原代成骨細(xì)胞在兩種材料表面伸展良好,細(xì)胞在材料表面伸出很多偽足,表明細(xì)胞易于粘附材料表面,并且在材料表面可見(jiàn)明顯的細(xì)胞外基質(zhì)沉積,說(shuō)明材料有良好的生物相容性。
　　 3、 MTT結(jié)果:兩組材料上細(xì)胞的MTT值從1、3、5、7d隨觀察時(shí)間逐漸升高。在1、3、5d,HA高于SiC

5、,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在7d,SiC快速上升,高于HA,兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明泡沫碳化硅很穩(wěn)定,并且沒(méi)有隨時(shí)間延長(zhǎng)而出現(xiàn)細(xì)胞毒性。
　　 4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期:在1、3、5、7d檢測(cè)PI值,1、3、5d兩組材料的PI值逐漸升高,高峰出現(xiàn)在第5d;7d時(shí)下降,兩組材料在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PI值均接近,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明成骨細(xì)胞在SiC上的增殖情況與HA相似。
　　 5、ALP結(jié)果:兩組材料上細(xì)胞的ALP含

6、量從1、3、5、7d隨觀察時(shí)間逐漸升高。在1d時(shí),HA高于SiC,在3、5、7d,HA低于SiC,但是兩組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明SiC對(duì)成骨細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用。
　　 6、實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果:OCN的mRNA結(jié)果:1、5、10d SiC組隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高;HA組最高峰在5d,10d下降但高于1d;1d和5d HA組顯著高于SiC組,10d二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。Cbfa1的mRNA結(jié)果:1、5、10d SiC組和HA組的