體外組織工程支架材料的制備及其對成骨細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、因為從患者身上獲取種子細(xì)胞來源有限，所以如何實現(xiàn)種子細(xì)胞體外高活性快速擴增成為組織工程及時治療患者的瓶頸問題之一。三維體外細(xì)胞培養(yǎng)是實現(xiàn)種子細(xì)胞體外高活性快速擴增的有效途徑，而應(yīng)用三維多孔支架材料是該方案能否實現(xiàn)的關(guān)鍵。本論文對體外組織工程三維支架材料制備與調(diào)控細(xì)胞增殖行為機制等關(guān)鍵科學(xué)問題進(jìn)行了探索和研究，以奠定實現(xiàn)組織工程中種子細(xì)胞體外高活性擴增的研究基礎(chǔ)。
　　本論文以發(fā)泡法、模板法制備多孔炭支架材料，并在此基礎(chǔ)上采用羥基磷

2、灰石涂層對其進(jìn)行表面修飾，制備HA/多孔炭支架材料，用于實現(xiàn)成骨細(xì)胞體外高活性擴增。該支架具有較高的平均開孔率(83.5％)和三維連通多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔徑分布為200-500μm，力學(xué)性能與多孔炭基體一致，表面細(xì)密的片/針狀羥基磷灰石涂層對提高細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用明顯，并且加速細(xì)胞的附著行為。與傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)模型相比，HA/多孔炭支架材料能顯著提高細(xì)胞的增殖行為;經(jīng)過7d培養(yǎng)后，發(fā)泡法、模板法制備的HA/多孔炭支架材料的細(xì)胞增殖率分別為

3、6.7倍、10.1倍，而在傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)的細(xì)胞增殖率僅為4.2倍。利用HA/多孔炭支架材料，初步設(shè)計小型灌注式生物反應(yīng)器構(gòu)建體外三維細(xì)胞培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)動態(tài)培養(yǎng)7d后細(xì)胞數(shù)量為靜態(tài)培養(yǎng)的2.4倍。
　　本論文研究了溶劑鑄造和粒子溶出法制備淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料，并利用中藥有效成分促進(jìn)成骨細(xì)胞體外高活性擴增。實驗數(shù)據(jù)表明，淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料的平均開孔率為88.8％，抗壓強度為0.27MPa。藥物釋放曲線檢測表明，淫

4、羊藿苷/PHBV多孔支架材料第一天即可檢測到向溶液中釋放中藥成分，濃度約為4.67mg/L，并且在28d內(nèi)可以觀察到淫羊藿苷的連續(xù)釋放過程，且未出現(xiàn)藥物的突釋現(xiàn)象。同時還發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞與支架材料接觸培養(yǎng)時，經(jīng)5d培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖率為非接觸組的1.5倍，由此表明細(xì)胞在支架材料的接觸式培養(yǎng)可有效促進(jìn)中藥成分因子通過細(xì)胞膜直接進(jìn)入細(xì)胞，提高藥物利用率。與此同時，對比細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板和淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料的增殖率發(fā)現(xiàn)，MG-63細(xì)胞培養(yǎng)在

5、淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料時細(xì)胞的增殖率增加2.3倍，MC3T3-E1細(xì)胞增加1.7倍。通過RT-PCR檢測MG-63細(xì)胞在二維培養(yǎng)皿、二維PHBV膜、三維PHBV多孔支架材料和三維淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料四種材料上RNA轉(zhuǎn)錄行為，發(fā)現(xiàn)三維淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料在細(xì)胞附著時會強化FN與TGF-β1兩個基因的轉(zhuǎn)錄水平，增強細(xì)胞外基質(zhì)的形成;在前期增殖行為中誘導(dǎo)了一些生長因子基因和細(xì)胞外基質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白相

6、關(guān)基因BMP2、BMP6、BMP7，最后強化細(xì)胞外基質(zhì)基因BGN轉(zhuǎn)錄行為，提高細(xì)胞外基質(zhì)對生長因子的錨定作用，而三維空間結(jié)構(gòu)在細(xì)胞增殖期間抑制TGF-β1和Col-I轉(zhuǎn)錄。利用淫羊藿苷/PHBV多孔支架材料，初步設(shè)計中型灌注式生物反應(yīng)器構(gòu)建體外三維細(xì)胞培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)動態(tài)培養(yǎng)最多使細(xì)胞數(shù)量為靜態(tài)培養(yǎng)的4倍。
　　本論文研究了利用溶劑揮發(fā)法在多孔炭支架材料表面修飾載藥PHBV涂層，制備載藥PHBV/多孔炭支架材料，考察其對細(xì)胞增殖的調(diào)

7、控作用。實驗數(shù)據(jù)表明，制備的載藥PHBV/多孔炭支架材料平均開孔率相較于多孔炭支架材料有所下降，均值為84.2％，但保留了三維多孔連通網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，連通孔孔徑范圍為200-500μm，抗壓強度、抗折強度和抗拉強度分別為1.076MPa、0.819MPa和0.187MPa。載藥PHBV/多孔炭支架材料同樣發(fā)現(xiàn)具有可控藥物釋放行為，經(jīng)過7d的釋放PBS中藥物濃度為0.727mg/L，而在28d后該值達(dá)到了1.207mg/L。載藥PHBV/多孔炭

8、支架材料上細(xì)胞的附著行為正常，在經(jīng)過3d的培養(yǎng)后，能明顯增強細(xì)胞的增殖，培養(yǎng)7d后MG-63細(xì)胞達(dá)到10倍的增殖，為二維細(xì)胞培養(yǎng)的2.5倍。
　　總之，本論文通過系統(tǒng)研究體外組織工程細(xì)胞培養(yǎng)多孔炭支架、多孔PHBV支架的制備與表征，發(fā)現(xiàn)經(jīng)HA、PHBV、淫羊藿苷對上述支架進(jìn)行表面修飾后，能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖行為，論文進(jìn)一步闡明了支架材料及表面修飾對細(xì)胞增殖影響的生物學(xué)機制，為支架材料應(yīng)用于組織工程種子細(xì)胞的體外擴增奠定了理論基