氧化型谷胱甘肽復(fù)方注射液抗大鼠肝纖維化的藥效及機制研究.pdf

1、肝纖維化（HF）是慢性肝病常見的一種病理過程，是慢性肝損傷發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)之路。其實質(zhì)是由活化的肝星狀細胞(HSC)所產(chǎn)生的以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的細胞外基質(zhì)（ECM）在肝臟的異常增生和沉積。肝纖維化的形成涉及多種細胞、細胞因子及肝臟細胞外基質(zhì)（ECM）的變化，各種因素之間相互交錯、相互影響，形成一個相當(dāng)復(fù)雜的動態(tài)變化網(wǎng)絡(luò)。HSC的活化、增殖是肝纖維化發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，ECM在肝臟大量沉積是肝纖維化的基本特征。經(jīng)研究證實，肝纖維化經(jīng)有效的干

2、預(yù)后是可以逆轉(zhuǎn)的，而肝硬化較難逆轉(zhuǎn)。所以，尋求有效的方法和藥物，是當(dāng)今肝病領(lǐng)域研究的一個熱點。
　　氧化應(yīng)激（OS）是機體或細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)過度產(chǎn)生和/或抗氧化防御功能減弱，引起兩者嚴重失衡，造成組織、細胞損傷的一種狀態(tài)。大量研究證實，氧化應(yīng)激是各種病因所致肝纖維化的重要機制之一，其伴隨了肝纖維化發(fā)病的始終。因此，針對氧化應(yīng)激應(yīng)用抗氧化劑治療各種肝纖維化是切實可行的。
　　谷胱甘肽作為生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中最重要的

3、小分子活性肽，在體內(nèi)以兩種形態(tài)存在,即還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。谷胱甘肽主要通過其巰基氧化-還原態(tài)的轉(zhuǎn)換，作為可逆的供氫體，在細胞的水相提供抗氧化保護。生物體內(nèi)大量存在并起主要生物學(xué)功能的是GSH，在臨床上外源性補充GSH可以起到很好的保護肝細胞的作用。目前，一種主要成分為GSSG的全新的抗肝纖維化藥品 Molixian已在俄羅斯上市。氧化型谷胱甘肽復(fù)方注射液(CGII)是根據(jù)Molixian仿制而成，其主要

4、成分為GSSG和肌苷（INO）。前期研究表明，CGII對二甲基甲酰胺（DMNA）誘導(dǎo)的肝硬化大鼠模型有較好療效。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因時代研究的一個重要內(nèi)容，可以動態(tài)、整體的研究疾病發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)種類及數(shù)量的變化，是一種有效的高通量研究模式，有助于探討疾病的發(fā)生機制、尋找疾病診斷的特異性標志物和藥物治療的靶點。
　　目的：通過復(fù)制大鼠免疫性肝纖維化模型，經(jīng) CGII干預(yù)后，觀察肝纖維化模型大鼠的多個病理改變，力求證

5、實其是否有效干預(yù)大鼠肝纖維化，并探討其抗大鼠肝纖維化作用的分子機制。
　　方法：將100只Wistar雄性大鼠隨機分為正常對照組和造模組。造模組大鼠予豬血清腹腔注射誘導(dǎo)肝纖維化成功后，隨機分為肝纖維化模型組（NS1ml?kg-1）、CGII高、中、低劑量組（CGII，10.8、5.4、2.7mg?kg-1）、GSSG組（GSSG，3.83mg?kg-1）、INO組（INO，1.57mg?kg-1）及GSH組（GSH，108 mg?

6、kg-1）。每日肌肉注射一次給藥，連續(xù)6周（除正常對照組和GSH組外，其余各組均予盲法給藥）。用全自動生化儀測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）含量；用放免法測血清透明質(zhì)酸（HA）含量；稱取肝臟濕重，計算肝臟指數(shù)；用紫外分光法檢測肝組織羥脯氨酸（Hyp）、丙二醛（MDA）含量及谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和谷胱甘肽還原酶（GR）的活性；用酶標法檢測肝組織GSH、GSSG含量；

7、用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)改變；用免疫組織化學(xué)法檢測Ⅲ型膠原（ColⅢ）、Bcl-2、Bax、基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13)及金屬蛋白酶組織抑制劑1（TIMP1）蛋白的表達；實時熒光定量RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax、血小板衍生生長因子-B（PDGF-B）及轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）mRNA的表達；用免疫印跡法（western blotting）檢測PDGF-B及TGF-β1蛋白的表達；用雙向凝膠電泳

8、-蛋白質(zhì)譜（2-DE-MALDI-TOF-MS）分析技術(shù)，篩選肝組織差異表達蛋白并鑒定。
　　結(jié)果：在豬血清作用下，大鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST、HA水平及肝組織Hyp、MDA及GSSG含量明顯增高；肝組織GSH含量及GST、GSH-Px、GR的活性明顯降低；肝纖維化程度明顯；肝組織ColⅢ、Bcl-2、Bax、MMP13、TIMP1、PDGF-B及TGF-β1的mRNA和/或蛋白表達明顯增高。與肝纖維化模型組相比，CGII高

9、、中劑量組大鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST、HA水平及肝組織Hyp、MDA含量明顯降低；肝組織GSH含量及GST、GSH-Px的活性明顯升高；肝纖維化程度明顯減輕；肝組織ColⅢ、Bcl-2、Bax、TIMP1、PDGF-B及TGF-β1的mRNA和/或蛋白表達明顯降低，MMP13蛋白表達明顯增高。其余各組與肝纖維化模型組相比，多項指標有所改善，但不及 CGII高、中劑量組明顯。篩選并鑒定出肝組織差異表達蛋白24種。
　　結(jié)論：C

10、GII能有效地對抗豬血清誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，藥效呈劑量依賴關(guān)系。CGII可以通過增加肝纖維化大鼠肝組織GSH含量、GSH-Px及GST活性、MMP13蛋白的表達以及降低PDGF-B、TGF-β1、Bcl-2、Bax、TIMP1 mRNA和/或蛋白的表達來拮抗大鼠肝纖維化，因此，CGII是一種較有希望的抗肝纖維化藥物。在各組大鼠肝組織差異表達蛋白中，熱休克蛋白90(HSP90)、S-谷胱甘肽化的碳酸酐酶Ⅲ（S-Glu-CAⅢ）、谷胱甘肽-