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文檔簡介
1、肝纖維化(Hepatic Fibrosis)是肝細胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時,肝內(nèi)纖維及成纖維結(jié)締組織增生的病理過程,是慢性肝病可逆轉(zhuǎn)的重要病理階段,也是發(fā)展為肝硬化形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。肝星狀細胞(H S C)是位于D i s s e間隙的一種間質(zhì)細胞。肝損傷后期表型發(fā)生轉(zhuǎn)變,可大量增殖并產(chǎn)生各種細胞外基質(zhì),并可通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物而抑制細胞外基質(zhì)降解,故在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。臨床上以肝臟活檢為診斷肝纖維化的最可靠方法。
2、體內(nèi)實驗研究以血清學(xué)四項指標和病理學(xué)檢測居多。我國肝病發(fā)病率極高,據(jù)保守估計各類肝炎病毒攜帶者及患者超過一億,對肝纖維化可逆轉(zhuǎn)階段的藥物干預(yù)研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。 目的: 丹參酮Ⅱ A磺酸鈉注射液目前臨床用于心血管病的治療,因其療效確切,該藥的社會需求將會逐漸增加。此藥的生產(chǎn)工藝也已經(jīng)很成熟,并且丹參已實現(xiàn)規(guī)范化種植(GAP)。這將為其在將來的治療肝纖維化的新的臨床應(yīng)用帶來極大方便和良好前景。丹參已有抗肝纖維
3、的研究報道,丹參酮ⅡA有促進HSC凋亡的初步研究。但是丹參酮Ⅱ A磺酸鈉注射液還無相關(guān)報道。本課題通過研究該制劑體內(nèi)和體外的抗肝纖維化的作用和機制為其抗肝纖維化的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。對此藥新藥理作用的研究開發(fā)必會帶來廣闊的社會效益和經(jīng)濟效益。 方法: 體外研究: 1.體外細胞的培養(yǎng):表型活化的HSC-T<,6>細胞用含10﹪胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基。置于37℃,5﹪CO<,2>恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當細
4、胞呈單層貼壁生長至80﹪~90﹪時進行傳代 2.臺盼藍染色檢測HSC-T<,6>細胞存活率3.MTT比色法檢測丹參酮HA磺酸鈉注射液對HSC-T<,6>細胞增殖的影響4.細胞培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測5.放免法檢測丹參酮пA磺酸鈉注射液對HSC分泌Ⅳ型膠原(cⅣ)的影響6.ELISA法檢測丹參酮пA磺酸鈉注射液對HSC分泌TGF-β<,1>蛋白的影響7.流式細胞儀檢測丹參酮пA磺酸鈉注射液對HSC凋亡率的影響8.對照組與藥物組培
5、養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下連續(xù)動態(tài)觀察丹參酮пA磺酸鈉注射液對HSC細胞作用后的形態(tài)9.熒光染色觀察正常、凋亡和死亡HSC體內(nèi)研究1.模型制備:河南省實驗動物中心購買清潔級大鼠108只,除正常對照組外各受試動物均采用未滅活豬血清腹腔注射,2次/周,每次0.5ml/只,連續(xù)8W。 2.病理標本的制備:取肝臟左葉相同部位,常規(guī)固定、石蠟包埋、切片,做HE染色觀察肝細胞變性、壞死程度3.放免法檢測血清纖維化指標HA、LN、PC Ⅲ及
6、Ⅳ-C的含量變化結(jié)果: 體外 1.隨著丹參酮HA磺酸鈉注射液作用時間延長和藥物濃度遞增,HSC增值抑制的效應(yīng)逐漸明顯,并表現(xiàn)出良好的量-效相關(guān)性和時.效相關(guān)性。 2.細胞形態(tài)學(xué)觀察可見隨著藥物濃度的增加HSC分裂增殖趨于緩慢,細胞外形也從不規(guī)則的星形、梭形等變?yōu)闄E圓形,圓形,并有碎裂現(xiàn)象。 3.丹參酮пA磺酸鈉注射液對于HSC的抑制作用不是非特異性細胞毒性所致。 4.Ⅳ型膠原含量隨著藥物濃度的增加
7、而逐漸減少,各藥物組和對照組之間差異具有顯著性。 5.TGF-β<,1>蛋白含量隨著藥物濃度而逐漸減少。實驗組與對照組相比TGF-β<,1>蛋白含量均有顯著性差異。 6.HSC的凋亡率隨藥物濃度增加而增加具有一定的量一效關(guān)系。 體內(nèi) 動物情況:正常對照組發(fā)育良好,活動正常。模型組動物狀態(tài)一般,體重增加緩慢但無顯著性差異,藥物組狀態(tài)比模型組較好。 病理觀察:空白對照組肝臟中肝小葉分界不清,結(jié)構(gòu)完整,
8、無壞死,無炎細胞浸潤及纖維組織增生(圖1)。模型組肝組織病理損害嚴重,肝索排列紊亂,肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,肝小葉周圍明顯壞死,形成假小葉,經(jīng)過丹參酮HA磺酸鈉注射液給藥后,高、中、低劑量預(yù)防組和治療組均未出現(xiàn)假小葉,并且高、中劑量組纖維增生較少,局限于匯管區(qū),肝小葉結(jié)構(gòu)輕度紊亂。(圖3圖4);低劑量組療效較差,纖維組織由匯管區(qū)向周圍延伸(圖5)。 丹參酮HA磺酸鈉注射液對血清HA、CⅣ、PCⅢ、LN的影響:模型組與正常對照組相比,大
9、鼠血清中的HA、CⅣ、PCⅢ、:LN顯著升高。與模型組相比,丹參酮Ⅱ A磺酸鈉各劑量組的預(yù)防組和治療組均在不同程度出現(xiàn)大鼠血清中HA、CⅣ、PCⅢ、LN顯著降低,且高劑量組的降低最多。 結(jié)論: 體外 1.丹參酮HA磺酸鈉注射液隨著作用時間延長和藥物濃度遞增,HSC增值抑制的效應(yīng)逐漸明顯,并呈現(xiàn)出良好的量.效和時.效關(guān)系;并使HSC形態(tài)發(fā)生變化。 2.丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液體外能抑制:HSCⅣ型膠原合成、T
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