扶正化瘀方抗大鼠免疫性肝纖維化的實驗研究.pdf

1、背景:我國是肝病大國，僅慢性HBV感染者就約有9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例，而又約有12％～15％的慢性乙型肝炎患者在5年內(nèi)發(fā)展到肝硬化。肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的一個共同的中間病理過程，且具有可逆性，因此可以通過積極尋找阻止或治療肝纖維化的有效方法，預防慢性肝病發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。
　　肝纖維化是由于各種致病因子導致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，其中肝星狀細胞(hepatic stellate cel

2、l，HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，活化的HSC變成肌成纖維細胞(myofibroblast，MFB)，具有高度的增殖和合成細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的能力，是肝臟瘢痕組織的主要來源。在肝纖維化的發(fā)展過程中，隨著ECM在Disse間隙的沉積，肝竇內(nèi)皮細胞(liver sinusoidalendothelial cell，LSEC)的窗孔結(jié)構(gòu)逐漸減少甚至消失，內(nèi)皮下形成連續(xù)性基底膜，這一過程

3、稱為肝竇毛細血管化，是肝臟微循環(huán)障礙的重要病理機制，反過來又可以通過多種途徑促進肝纖維化的發(fā)展。因此，可以通過研究如何阻止HSC活化和逆轉(zhuǎn)肝竇毛細血管化來尋找有效抗肝纖維化的治療藥物。
　　扶正化瘀方（又稱319方）是由丹參、蟲草菌絲、桃仁、絞股藍、松花粉、五味子組成，針對肝纖維化“瘀血阻絡、正氣虛弱”的基本中醫(yī)病因研制而成。已在多種壞死后性肝纖維化動物模型及臨床研究中顯示了一定的抗肝纖維化作用，但對免疫性肝纖維化動物模型的作用研

4、究尚未見報道。本課題組在前期研究中已從細胞水平驗證了扶正化瘀方對HSC和LSEC兩類細胞功能的影響，認為扶正化瘀方可以通過抑制HSC增殖、下調(diào)HSC分泌ECM和逆轉(zhuǎn)肝竇毛細血管化來發(fā)揮抗肝纖維化作用，因此本研究以豬血清誘導的免疫性肝纖維化大鼠模型為基礎，以干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)干預為陽性對照，研究扶正化瘀方對免疫性肝纖維化的治療作用，并從HSC活化、分泌ECM及肝竇毛細血管化的角度探討其抗肝纖維化的可能機制，

5、為其臨床應用提供進一步的理論依據(jù)。
　　第一部分扶正化瘀方對大鼠免疫性肝纖維化的治療作用研究
　　目的: 觀察中藥扶正化瘀方對豬血清所致免疫性肝纖維化大鼠模型的治療作用及對平滑肌肌動蛋白α(alpha-sooth muscle actin，α-SMA)、結(jié)蛋白(desmin)表達水平的影響。
　　方法: 腹腔注射豬血清8周構(gòu)造大鼠肝纖維化模型，另設腹腔注射生理鹽水的正常大鼠對照組，第9周起將造模大鼠隨機分為模型組、IF

6、N-γ組及扶正化瘀方組，IFN-γ組與扶正化瘀方組在繼續(xù)給予腹腔注射豬血清的同時分別給予肌注IFN-γ、灌胃扶正化瘀方，模型組與正常組在繼續(xù)分別給予腹腔注射豬血清、生理鹽水的同時均給予灌胃等容積的消毒飲用水，代替扶正化瘀方，起對照作用，均至12周。末次給藥后次日處死全部實驗動物，取肝組織進行HE染色、Masson染色，按肝纖維化病理分期方案評價肝纖維化程度，并對膠原纖維面積百分比進行半定量分析;Western blot法檢測各組α-SM

7、A、desmin表達水平。
　　結(jié)果: 1.肝組織病理學結(jié)果顯示扶正化瘀方組肝纖維化程度及膠原纖維面積百分比較模型組明顯減輕，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而扶正化瘀方組、IFN-γ組組間無顯著差異(P＞0.05);2.Western blot結(jié)果顯示扶正化瘀方組α-SMA、desmin蛋白水平較模型組明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而扶正化瘀方組、IFN-γ組組間無顯著差異(P＞0.05);
　　結(jié)論:

8、 1.扶正化瘀方對大鼠免疫性肝纖維化有明顯的改善作用;2.扶正化瘀方組α-SMA、desmin蛋白表達水平明顯下調(diào)，膠原纖維面積百分比明顯減低，提示其抗肝纖維化機制可能與抑制HSC活化和下調(diào)ECM分泌有關(guān)。
　　第二部分扶正化瘀方對免疫性肝纖維化大鼠模型肝竇毛細血管化的逆轉(zhuǎn)作用研究
　　目的: 觀察中藥扶正化瘀方對豬血清所致免疫性肝纖維化大鼠模型肝竇毛細血管化的逆轉(zhuǎn)作用。
　　方法: 獲取第一部分實驗各組的肝組織標本，

9、Western blot法檢測各組肝組織標本第Ⅷ因子相關(guān)抗原(von Willebrandfactor，vWF)、CD31蛋白表達水平;透射電鏡觀察比較模型組和扶正化瘀方組肝竇結(jié)構(gòu)與內(nèi)皮下基底膜的改變。
　　結(jié)果: 1.Western blot結(jié)果顯示扶正化瘀方組vWF、CD31蛋白表達水平較模型組明顯下調(diào)(P＜0.05)，而扶正化瘀方組、IFN-γ組組間無顯著差異(P＞0.05);2.電鏡結(jié)果顯示與模型組相比，扶正化瘀方組肝竇扭