重樓治療慢性腎小球疾病的實驗研究.pdf

1、第一部分中藥重樓對膜性腎病大鼠的腎臟保護作用及其機制。 目的：探討中藥重樓對膜性腎病大鼠的腎臟保護作用及其作用機制。 方法：選用雄性大鼠37只，隨機選5只作為正常對照組(正常組)，其余32只予以尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白(C—BSA)復制大鼠原位免疫復合物性腎炎模型，其病理表現(xiàn)為膜性腎病(MN)。4周后將26只復制模型成功且存活的大鼠隨機分為MN大鼠模型對照組(模型組)，重樓治療組(重樓組)，雷公藤多甙治療組(雷公藤

2、多甙組，陽性對照組)。兩治療組分別以相應藥物灌胃4周，正常組及模型組給予等量蒸餾水灌胃。分別于實驗前、及實驗第3、4、8周后檢測大鼠24小時尿蛋白定量；實驗第8周處死大鼠，檢測大鼠血清白蛋白(ALB)、血清腎功能、血脂；檢測大鼠腎臟組織光鏡和電鏡病理改變；應用間接免疫熒光法檢測各組大鼠腎組織內免疫球蛋白G(IgG)、補體3(C3)的表達水平；應用免疫組織化學的方法測定各組大鼠腎組織標本Ⅳ型膠原(ColⅣ)表達和核轉錄因子-kappaB

3、p65(NF—K B p65)的活化；應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT—PCR)法檢測各組大鼠腎組織標本纖維連接蛋白(FN)mRNA表達水平。 結果：①實驗第3周造模各組出現(xiàn)大量尿蛋白，于第4周尿蛋白繼續(xù)升高，與正常組比較有顯著性差異(P<0.01)；兩治療組8周末的24小時尿蛋白定量與4周末比較顯著降低(P<0.05)，兩治療組間無明顯差異。②各組血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)比較無明顯差異；模型組與正常組比較，血清甘油

4、三酯(TG)、膽固醇(TC)均明顯升高，血清ALB明顯降低(P<0.05)；兩治療組的血清TG分別與正常對照組、模型組比較均無明顯差異，血TC均明顯低于模型組，血清ALB均明顯高于模型組(P<0.05)，兩治療組間上述指標比較無明顯差異。③間接免疫熒光顯示兩治療組IgG、C3的沉積均較模型組顯著減弱(P<0.01 orP<0.05)，兩治療組間無明顯差異。④光鏡下觀察模型組腎小球明顯腫脹，球內細胞增多，腎小球基底膜增厚及節(jié)段性釘突形成，

5、上皮下嗜復紅物質沉積；兩治療組腎小球基底膜增厚不明顯，上皮下沉積物均較少。半定量分析示模型組的腎小球球內細胞數(shù)、腎小球直徑、截面積均明顯大于正常組(P<0.05)；重樓組與雷公藤多甙組以上各指標均顯著小于模型組(P<0.05)；兩治療組間上述指標間的差異無統(tǒng)計學意義。 結論：①大鼠心模型制作成功；②中藥重樓能不同程度地減輕和清除心大鼠腎小球免疫復合物和細胞外基質(ECM)沉積，降低尿蛋白排泄和降低血膽固醇水平的作用；③NF-K

6、B p65在參與腎小球正常的新陳代謝及其生理功能中具有一定的作用。MN的發(fā)生與NF-K B p65的過度活化有密切關系。重樓可能通過調節(jié)腎組織NF-K B p65的活化來減輕腎損害。④重樓治療心大鼠的療效與雷公藤多甙相當，且部分作用機制相同。 第二部分重樓含藥血清對系膜細胞增殖、凋亡及分泌纖維連接蛋白的影響 目的：觀察中藥重樓含藥血清對體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞(MC)異常增殖、凋亡及分泌纖維連接蛋白(FN)的影響，以

7、便從細胞生物學及基因水平探討重樓防治腎小球疾病的作用機制。為該藥合理使用于臨床提供理論依據(jù)。 方法：選用雌雄各半的健康大鼠36只，隨機分為正常組，重樓高、中、低劑量組，雷公藤多甙組和強的松組，每組6只。分別灌服蒸餾水或相應的受試藥物用于制備正常大鼠血清、重樓(高、中、低劑量)含藥血清、對照藥雷公藤多甙及強的松含藥血清。將各組含藥血清分別與脂多糖(LPS)、體外培養(yǎng)的大鼠腎小球MC分別作用12小時、24小時和36小時。采用Cell

8、 Counting Kit-8(CCK-8)比色法，觀察重樓含藥血清對脂多糖刺激腎小球MC增殖的影響；采用Hoechst33258染色、流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染檢測大鼠腎小球MC凋亡及凋亡率；采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測各組細胞上清FN蛋白水平；采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測腎小球MC FN mRNA和抗凋亡基因bcl-2 mRNA表達水平。 結果：①CCK-8比色結果顯示：

9、脂多糖組與正常組在12小時、24小時和36小時3個時間點的吸光度(OD)值相比均顯著增高(P<0.01)，提示脂多糖能促進腎小球MC異常增殖。高、中劑量重樓組及雷公藤多甙組在12小時、24小時和36小時三個時間點的0D值均較脂多糖組顯著減低(P<0.01)；低劑量重樓組12小時時的0D值與脂多糖組比較無顯著差異，在24小時和36小時時的OD值均較脂多糖組顯著減低(P<0.01)，在24小時時重樓隨著劑量的增加，其OD值逐漸減低，3個劑量

10、組兩兩比較均有顯著性差異(P<0.01 or P<0.05)，提示重樓含藥血清和雷公藤多甙含藥血清能抑制LPS刺激所致的MC增殖，且重樓含藥血清的抑制作用存在一定的量效-時效關系；在36小時時重樓各劑量組的OD值均較24小時時高，提示36小時時其抑增殖作用較前有減弱趨勢；強的松組在12小時和24小時兩個時間點的0D值均顯著低于脂多糖組(P<0.01)，提示強的松含藥血清能抑制LPS刺激的腎小球MC增殖，但其抑增殖作用明顯弱于高、中、低劑

11、量重樓含藥血清及雷公藤多甙含藥血清(與重樓高、中劑量組及雷公藤多甙組比較P<0.01)；在12小時時雷公藤多甙組與重樓高劑量組的抑增殖作用相當，在24小時和36小時時，雷公藤多甙含藥血清的抑增殖作用不如高劑量重樓含藥血清(P<0.01 or P<0.05)。②Hoechst33258染色觀察顯示正常組MC胞膜完整，胞核染色較深且均一。重樓組的MC胞膜有不同程度的皺縮，染色質聚集，熒光增強，并伴不同形狀的碎裂，可見典型的凋亡小體形態(tài)。③流

12、式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染檢測結果顯示重樓各劑量組和雷公藤多甙組MC凋亡率較正常組均有顯著性增高(P<0.01)；在重樓各劑量組內，MC凋亡率隨重樓劑量的增加而呈遞增變化，且重樓中劑量組與重樓低劑量組之間有顯著差異(P<0.01)，提示重樓含藥血清對MC凋亡的誘導有一定的量效關系；雷公藤多甙組誘導的MC凋亡率顯著高于重樓各劑量組(P<0.01)，提示重樓含藥血清在一定劑量上誘導MC凋亡的作用弱于雷公藤多甙含藥血清；強

13、的松含藥血清對MC凋亡無明顯影響。 結論： ①重樓含藥血清可抑制MC的異常增生及MC過度分泌FN，此可能是重樓治療腎小球疾病取得臨床療效的內在機制。②重樓含藥血清對MC的抑制作用有一定的量效一時效關系，其中、高劑量與雷公藤多甙含藥血清的抑增殖作用相當，但高劑量重樓含藥血清對MC的抑制作用較雷公藤多甙含藥血清持久；低、中、高劑量重樓含藥血清抑增殖作用均顯著強于強的松含藥血清。③重樓含藥血清能誘導異常增生的MC凋亡及抑制MC

14、抗凋亡基因bcl-2 mRNA的表達，從而促使增殖的MC消散，進一步提示該中藥有減少MC增殖數(shù)量的作用，同時部分闡明其誘導MC凋亡的機制；重樓含藥血清誘導MC凋亡的作用弱于雷公藤多甙含藥血清。④本課題從細胞、細胞因子水平及基因水平再次證實了中醫(yī)藥治療腎小球疾病的可行性、有效性，表明中醫(yī)藥對腎小球疾病的治療作用并非僅僅限于改善臨床癥狀、體征及生化指標，除此之外尚有其深刻的內在機制，值得進一步研究。 第三部分重樓含藥血清對系膜細胞核

15、轉錄因子-kappaB表達影響的實驗研究 目的：探討重樓含藥血清對脂多糖(LPS)誘導的腎小球系膜細胞(MC)核轉錄因子-kappaB(NF-K B)活性的影響。 方法：采用血清藥理學實驗方法和MC體外培養(yǎng)方法，制備重樓和對照藥雷公藤多甙及強的松含藥血清，將各組含藥血清分別與脂多糖、體外培養(yǎng)的大鼠腎小球MC作用24小時，收集細胞用于抽提總RNA，采用RT-PCR檢測各組系膜細胞NF-K B mRNA水平。 結果：

16、NF-K B mRNA在正常組有少量表達；在脂多糖組NF-K BmRNA表達量顯著增加(P<0.01)；重樓各劑量組、雷公藤多甙組及強的松組較脂多糖組NF-K B mRNA表達量顯著減少(P<0.01)；雷公藤多甙組NF-K B mRNA表達量明顯低于重樓各劑量組(P<0.01 orP<0.05)；強的松組NF-K B mRNA表達量明顯高于重樓高劑量組(P<0.05)。 結論：重樓含藥血清、雷公藤多甙含藥血清及強的松含藥血清均