重樓治療慢性腎小球疾病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分中藥重樓對膜性腎病大鼠的腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制。 目的：探討中藥重樓對膜性腎病大鼠的腎臟保護(hù)作用及其作用機(jī)制。 方法：選用雄性大鼠37只，隨機(jī)選5只作為正常對照組(正常組)，其余32只予以尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白(C—BSA)復(fù)制大鼠原位免疫復(fù)合物性腎炎模型，其病理表現(xiàn)為膜性腎病(MN)。4周后將26只復(fù)制模型成功且存活的大鼠隨機(jī)分為MN大鼠模型對照組(模型組)，重樓治療組(重樓組)，雷公藤多甙治療組(雷公藤

2、多甙組，陽性對照組)。兩治療組分別以相應(yīng)藥物灌胃4周，正常組及模型組給予等量蒸餾水灌胃。分別于實(shí)驗(yàn)前、及實(shí)驗(yàn)第3、4、8周后檢測大鼠24小時(shí)尿蛋白定量；實(shí)驗(yàn)第8周處死大鼠，檢測大鼠血清白蛋白(ALB)、血清腎功能、血脂；檢測大鼠腎臟組織光鏡和電鏡病理改變；應(yīng)用間接免疫熒光法檢測各組大鼠腎組織內(nèi)免疫球蛋白G(IgG)、補(bǔ)體3(C3)的表達(dá)水平；應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法測定各組大鼠腎組織標(biāo)本Ⅳ型膠原(ColⅣ)表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB

3、p65(NF—K B p65)的活化；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)法檢測各組大鼠腎組織標(biāo)本纖維連接蛋白(FN)mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：①實(shí)驗(yàn)第3周造模各組出現(xiàn)大量尿蛋白，于第4周尿蛋白繼續(xù)升高，與正常組比較有顯著性差異(P<0.01)；兩治療組8周末的24小時(shí)尿蛋白定量與4周末比較顯著降低(P<0.05)，兩治療組間無明顯差異。②各組血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)比較無明顯差異；模型組與正常組比較，血清甘油

4、三酯(TG)、膽固醇(TC)均明顯升高，血清ALB明顯降低(P<0.05)；兩治療組的血清TG分別與正常對照組、模型組比較均無明顯差異，血TC均明顯低于模型組，血清ALB均明顯高于模型組(P<0.05)，兩治療組間上述指標(biāo)比較無明顯差異。③間接免疫熒光顯示兩治療組IgG、C3的沉積均較模型組顯著減弱(P<0.01 orP<0.05)，兩治療組間無明顯差異。④光鏡下觀察模型組腎小球明顯腫脹，球內(nèi)細(xì)胞增多，腎小球基底膜增厚及節(jié)段性釘突形成，

5、上皮下嗜復(fù)紅物質(zhì)沉積；兩治療組腎小球基底膜增厚不明顯，上皮下沉積物均較少。半定量分析示模型組的腎小球球內(nèi)細(xì)胞數(shù)、腎小球直徑、截面積均明顯大于正常組(P<0.05)；重樓組與雷公藤多甙組以上各指標(biāo)均顯著小于模型組(P<0.05)；兩治療組間上述指標(biāo)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：①大鼠心模型制作成功；②中藥重樓能不同程度地減輕和清除心大鼠腎小球免疫復(fù)合物和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積，降低尿蛋白排泄和降低血膽固醇水平的作用；③NF-K

6、B p65在參與腎小球正常的新陳代謝及其生理功能中具有一定的作用。MN的發(fā)生與NF-K B p65的過度活化有密切關(guān)系。重樓可能通過調(diào)節(jié)腎組織NF-K B p65的活化來減輕腎損害。④重樓治療心大鼠的療效與雷公藤多甙相當(dāng)，且部分作用機(jī)制相同。 第二部分重樓含藥血清對系膜細(xì)胞增殖、凋亡及分泌纖維連接蛋白的影響 目的：觀察中藥重樓含藥血清對體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(MC)異常增殖、凋亡及分泌纖維連接蛋白(FN)的影響，以

7、便從細(xì)胞生物學(xué)及基因水平探討重樓防治腎小球疾病的作用機(jī)制。為該藥合理使用于臨床提供理論依據(jù)。 方法：選用雌雄各半的健康大鼠36只，隨機(jī)分為正常組，重樓高、中、低劑量組，雷公藤多甙組和強(qiáng)的松組，每組6只。分別灌服蒸餾水或相應(yīng)的受試藥物用于制備正常大鼠血清、重樓(高、中、低劑量)含藥血清、對照藥雷公藤多甙及強(qiáng)的松含藥血清。將各組含藥血清分別與脂多糖(LPS)、體外培養(yǎng)的大鼠腎小球MC分別作用12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)。采用Cell

8、 Counting Kit-8(CCK-8)比色法，觀察重樓含藥血清對脂多糖刺激腎小球MC增殖的影響；采用Hoechst33258染色、流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染檢測大鼠腎小球MC凋亡及凋亡率；采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測各組細(xì)胞上清FN蛋白水平；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測腎小球MC FN mRNA和抗凋亡基因bcl-2 mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：①CCK-8比色結(jié)果顯示：

9、脂多糖組與正常組在12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)3個時(shí)間點(diǎn)的吸光度(OD)值相比均顯著增高(P<0.01)，提示脂多糖能促進(jìn)腎小球MC異常增殖。高、中劑量重樓組及雷公藤多甙組在12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)三個時(shí)間點(diǎn)的0D值均較脂多糖組顯著減低(P<0.01)；低劑量重樓組12小時(shí)時(shí)的0D值與脂多糖組比較無顯著差異，在24小時(shí)和36小時(shí)時(shí)的OD值均較脂多糖組顯著減低(P<0.01)，在24小時(shí)時(shí)重樓隨著劑量的增加，其OD值逐漸減低，3個劑量

10、組兩兩比較均有顯著性差異(P<0.01 or P<0.05)，提示重樓含藥血清和雷公藤多甙含藥血清能抑制LPS刺激所致的MC增殖，且重樓含藥血清的抑制作用存在一定的量效-時(shí)效關(guān)系；在36小時(shí)時(shí)重樓各劑量組的OD值均較24小時(shí)時(shí)高，提示36小時(shí)時(shí)其抑增殖作用較前有減弱趨勢；強(qiáng)的松組在12小時(shí)和24小時(shí)兩個時(shí)間點(diǎn)的0D值均顯著低于脂多糖組(P<0.01)，提示強(qiáng)的松含藥血清能抑制LPS刺激的腎小球MC增殖，但其抑增殖作用明顯弱于高、中、低劑

11、量重樓含藥血清及雷公藤多甙含藥血清(與重樓高、中劑量組及雷公藤多甙組比較P<0.01)；在12小時(shí)時(shí)雷公藤多甙組與重樓高劑量組的抑增殖作用相當(dāng)，在24小時(shí)和36小時(shí)時(shí)，雷公藤多甙含藥血清的抑增殖作用不如高劑量重樓含藥血清(P<0.01 or P<0.05)。②Hoechst33258染色觀察顯示正常組MC胞膜完整，胞核染色較深且均一。重樓組的MC胞膜有不同程度的皺縮，染色質(zhì)聚集，熒光增強(qiáng)，并伴不同形狀的碎裂，可見典型的凋亡小體形態(tài)。③流

12、式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染檢測結(jié)果顯示重樓各劑量組和雷公藤多甙組MC凋亡率較正常組均有顯著性增高(P<0.01)；在重樓各劑量組內(nèi)，MC凋亡率隨重樓劑量的增加而呈遞增變化，且重樓中劑量組與重樓低劑量組之間有顯著差異(P<0.01)，提示重樓含藥血清對MC凋亡的誘導(dǎo)有一定的量效關(guān)系；雷公藤多甙組誘導(dǎo)的MC凋亡率顯著高于重樓各劑量組(P<0.01)，提示重樓含藥血清在一定劑量上誘導(dǎo)MC凋亡的作用弱于雷公藤多甙含藥血清；強(qiáng)

13、的松含藥血清對MC凋亡無明顯影響。 結(jié)論： ①重樓含藥血清可抑制MC的異常增生及MC過度分泌FN，此可能是重樓治療腎小球疾病取得臨床療效的內(nèi)在機(jī)制。②重樓含藥血清對MC的抑制作用有一定的量效一時(shí)效關(guān)系，其中、高劑量與雷公藤多甙含藥血清的抑增殖作用相當(dāng)，但高劑量重樓含藥血清對MC的抑制作用較雷公藤多甙含藥血清持久；低、中、高劑量重樓含藥血清抑增殖作用均顯著強(qiáng)于強(qiáng)的松含藥血清。③重樓含藥血清能誘導(dǎo)異常增生的MC凋亡及抑制MC

14、抗凋亡基因bcl-2 mRNA的表達(dá)，從而促使增殖的MC消散，進(jìn)一步提示該中藥有減少M(fèi)C增殖數(shù)量的作用，同時(shí)部分闡明其誘導(dǎo)MC凋亡的機(jī)制；重樓含藥血清誘導(dǎo)MC凋亡的作用弱于雷公藤多甙含藥血清。④本課題從細(xì)胞、細(xì)胞因子水平及基因水平再次證實(shí)了中醫(yī)藥治療腎小球疾病的可行性、有效性，表明中醫(yī)藥對腎小球疾病的治療作用并非僅僅限于改善臨床癥狀、體征及生化指標(biāo)，除此之外尚有其深刻的內(nèi)在機(jī)制，值得進(jìn)一步研究。 第三部分重樓含藥血清對系膜細(xì)胞核

15、轉(zhuǎn)錄因子-kappaB表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討重樓含藥血清對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞(MC)核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB(NF-K B)活性的影響。 方法：采用血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和MC體外培養(yǎng)方法，制備重樓和對照藥雷公藤多甙及強(qiáng)的松含藥血清，將各組含藥血清分別與脂多糖、體外培養(yǎng)的大鼠腎小球MC作用24小時(shí)，收集細(xì)胞用于抽提總RNA，采用RT-PCR檢測各組系膜細(xì)胞NF-K B mRNA水平。 結(jié)果：

16、NF-K B mRNA在正常組有少量表達(dá)；在脂多糖組NF-K BmRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；重樓各劑量組、雷公藤多甙組及強(qiáng)的松組較脂多糖組NF-K B mRNA表達(dá)量顯著減少(P<0.01)；雷公藤多甙組NF-K B mRNA表達(dá)量明顯低于重樓各劑量組(P<0.01 orP<0.05)；強(qiáng)的松組NF-K B mRNA表達(dá)量明顯高于重樓高劑量組(P<0.05)。 結(jié)論：重樓含藥血清、雷公藤多甙含藥血清及強(qiáng)的松含藥血清均