二甲基精氨酸-二甲胺水解酶對內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老的調(diào)控與糖尿病血管功能障礙.pdf

1、第一章、二甲基精氨酸-二甲胺水解酶對內(nèi)皮祖細(xì)胞分化及功能的調(diào)控作用
　　 背景：
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞是一類能分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞,促進(jìn)血管新生和改善心功能的干細(xì)胞。EPCs參與血管修復(fù)和血管新生,為治療缺血性疾病提供了新的策略。
　　 血管內(nèi)皮生長因子是調(diào)節(jié)EPCs功能最強(qiáng)的因子。VEGF與2型VEGF受體(KDR)相互作用而調(diào)節(jié)EPCs功能,包括內(nèi)皮修復(fù)與血管新生。
　　 二甲基精氨酸-二甲胺水

2、解酶能特異性的水解L-精氨酸的同類物非對稱二甲基精氨酸。ADMA是一種主要的內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物,能競爭性抑制NOS,減少一氧化氮合成。研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細(xì)胞衰老和血管新生涉及DDAH/ADMA途徑。
　　 人類沉默信息調(diào)節(jié)因子2(Silent information regulator2,Sir2)SIRT1是Ⅲ型組蛋白去乙酰化蛋白,能引起基因表達(dá)沉默。研究發(fā)現(xiàn),SIRT1通過DDAH/ADMA途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞衰老。文獻(xiàn)報道,

3、高糖誘導(dǎo)EPCs衰老涉及SIT1途徑。
　　 基于DDAIMADMA與SIRT1參與血管新生及細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)以及SIRT1介導(dǎo)DDAH/ADMA途徑的效應(yīng),我們推測DDAH/ADMA可能通過VEGF/KDR途徑參與EPCs分化與功能的調(diào)控,該作用可能涉及SIRT1途徑。因此,本實驗在體外培養(yǎng)人外周血來源EPCs研究了DDAH/ADMA對EPCs功能與衰老的影響。
　　 方法：
　　 EPCs培養(yǎng)與鑒定:梯度離心加

4、選擇性粘附分離健康人外周血EPCs,用內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基EBM-2培養(yǎng)EPCs。培養(yǎng)7天后鑒定,包括乙?；兔芏戎鞍着c荊豆凝集素1雙染鑒定分化EPCs;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞CD133、CD34、CD45、KDR、vWF等標(biāo)記物表達(dá)。
　　 DDAH對EPCs分化及功能調(diào)控及機(jī)制:提取分化第7天的EPCs,檢測DDAH1和DDAH2表達(dá);提取第7和17天EPCs,檢測JDDAH2、SIRT1表達(dá)。為了探討DDAH2對EPCs功能的調(diào)控

5、,運用pGCSIL-GFP-hDDAH2慢病毒轉(zhuǎn)染EPCs沉默DDAH2表達(dá);為了探討SIRT1對DDAH2表達(dá)的調(diào)控,運用pGCSIL-GFP-hSIRT1慢病毒轉(zhuǎn)染EPCs沉默SIRT1表達(dá)。提取細(xì)胞mRNA,Real-time PCR檢測DDAH1、DDAH2、SIRT1、VEGF和KDR mRNA表達(dá);流式細(xì)胞儀和WesternBlot檢測DDAH2和SIRT1蛋白表達(dá);高效液相色譜法(highperformance liqui

6、d chromatography,HPLC)檢測細(xì)胞上清ADMA;β-半乳糖苷酶活性評價EPCs衰老程度:tubedx管形成實驗評價EPCs血管形成能力;纖維連接蛋白檢測EPCs粘附能力。
　　 結(jié)果：
　　 人外周血EPCs主要以DDAH2亞型表達(dá)為主,且隨著EPCs分化時間延長而增加。
　　 結(jié)論：
　　 DDAH2參與EPCs分化過程,并通過調(diào)節(jié)VEGF/KDR途徑抑制EPCs的衰老,其作用機(jī)制涉及

7、SIRT1途徑。
　　 第二章、二甲基精氨酸一二甲胺水解酶/非對稱二甲基精氨酸在2型糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老中的作用及機(jī)制
　　 研究背景
　　 血管病變是糖尿病主要并發(fā)癥之一。臨床與動物實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病時,EPCs衰老率顯著增加、功能受損。高糖能誘導(dǎo)EPCs衰老、血管形成能力減弱,導(dǎo)致糖尿病血管功能減弱、側(cè)枝循環(huán)建立減少,引發(fā)心血管疾病。
　　 ADMA是一種新的心血管疾病預(yù)測因子,是內(nèi)源性NOS抑制物,能競

8、爭性抑制NOS,減少NO的合成。糖尿病時,細(xì)胞DDAH2表達(dá)降低、活性減弱,引起ADMA濃度增加并抑制NO生成。臨床與動物實驗證明,糖尿病時EPCs功能受損與NO濃度降低有關(guān)。細(xì)胞實驗證明,ADMA能直接損傷EPCs功能。
　　 糖尿病或高糖孵育EPCs時,EPCs SIRT1表達(dá)下調(diào),同時伴隨細(xì)胞衰老和血管形成功能減退。內(nèi)皮細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn),SIRT1可上調(diào)DDAH2表達(dá),增加活性,促進(jìn)ADMA水解,抑制內(nèi)皮細(xì)胞自然衰老過程。

9、r>　　 本實驗在2型糖尿病患者與培養(yǎng)EPCs細(xì)胞探討了EPCs衰老與DDAH/ADMA之間的關(guān)系,以及該過程是否涉及SIRT1途徑。
　　 方法：
　　 臨床研究:對照組與2型糖尿病患者組各40例。取外周靜脈血,分離血漿與細(xì)胞。HPLC檢測血漿ADMA濃度;梯度離心加粘附分離細(xì)胞EPCs,β-半乳糖苷酶活性評價細(xì)胞衰老,Real-time PCR法檢測細(xì)胞DDAH2、SIRT1 mRNA表達(dá)。
　　 細(xì)胞實驗

10、:外源性給予葡萄糖(10,20,30 mmol/L)孵育EPCs建立高糖損傷EPCs細(xì)胞模型,以甘露醇(10,20,30 mmol/L)作為滲透壓對照組,探討高糖誘導(dǎo)EPCs衰老;構(gòu)建pGC-FU-hDDAH2慢病毒探討DDAH2抑制高糖誘導(dǎo)EPCs衰老;外源性給予ADMA(0,0.3,0.6,1μtmol/L)探討ADMA誘導(dǎo)EPCs衰老作用;運用SIRT1激動劑白藜蘆醇探討SIRT1調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞衰老作用機(jī)制。
　　 梯度

11、離心加粘附分離正常人外周血EPCs。細(xì)胞處理48 h后,β-半乳糖苷酶活性評價細(xì)胞衰老。其他指標(biāo)的檢測為細(xì)胞處理24 h時,Real-time PCR與Western Blot檢測DDAH2、SIRT1 mRNA與蛋白表達(dá),HPLC檢測細(xì)胞上清ADMA水平,Griess法檢測上清NO水平。
　　 結(jié)果：
　　 2型糖尿病患者外周血EPCs衰老率顯著升高,DDAH2與SIRT1mRNA表達(dá)下調(diào),同時伴隨ADMA水平升高。<

12、br>　　 結(jié)論：
　　 DDAH2/ADMA參與了高糖誘導(dǎo)的EPCs衰老,其作用涉及SIRT1途徑。
　　 第三章、白藜蘆醇衍生物改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗及抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老
　　 背景：
　　 白藜蘆醇(resveratrol,RSV)是一種多酚類的SIRT1天然激動劑。SIRT1參與糖代謝和胰島素分泌的調(diào)節(jié)。糖尿病大鼠實驗證明,RSV能上調(diào)VEGF與eNOS表達(dá),抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),提高糖尿病大

13、鼠骨髓細(xì)胞血管形成能力。細(xì)胞實驗證明,RSV促進(jìn)人外周血EPCs增殖、遷移以及血管新生。此外,RSV也能抑制TNF-α所致EPCs損傷。
　　 (E)-3,5,4'-三甲氧基-1,2-二苯乙烯((E)-3,5,4'-trimethoxystilbene,BTM-0512)是RSV的甲基化衍生物,其口服吸收率與半衰期均優(yōu)于RSV。
　　 依據(jù)RSV對血管內(nèi)皮和EPC保護(hù)作用以及SIRT1-DDAH2/ADMA對EPCs功能

14、及衰老的調(diào)節(jié)作用,本實驗在高脂飲食加單次腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘發(fā)的2型糖尿病大鼠模型與培養(yǎng)大鼠骨髓EPCs細(xì)胞,探討RSV衍生物BTM-0512能否改善胰島素抵抗,以及對EPCs衰老的影響及機(jī)制。
　　 方法：
　　 動物實驗:高脂飲食加單次腹腔注射STZ(35 mg/kg)建立2型糖尿病大鼠模型。實驗分為正常對照組、模型組、BTM-0512低劑量組(10 mg/kg)和BTM-05

15、12高劑量組(40 mg/kg)。大鼠連續(xù)灌胃3周。
　　 取大鼠全血,分離血漿檢測大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(Hb1AC)、葡萄糖耐量(OGTT)、HOME.IR、胰島素敏感指數(shù)(IAI)、胰島素分泌指數(shù)(IS)以及ADMA濃度。切取胸主動脈觀測內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng),免疫組化檢測血管內(nèi)皮DDAH2、SIRT1蛋白表達(dá)。采用梯度離心加選擇性粘附分離大鼠骨髓EPCs細(xì)胞,β-半乳糖苷酶活性評價細(xì)胞衰老程度,Real-tim

16、e PCR檢測EPCs DDAH2、SIRT1mRNA表達(dá),tube小管形成實驗檢測EPCs血管形成能力,transwell小室評價EPCs遷移能力,纖維連接蛋白粘附法評價EPCs粘附能力。
　　 細(xì)胞實驗:高糖處理EPCs,探討B(tài)TM-0512(0.3,1,3μM)抑制高糖誘導(dǎo)EPCs衰老及可能機(jī)制,給予SIRT1特異性阻斷劑splitomicin(50μM)探討SIRT1在BTM-0512對EPCs保護(hù)中作用。Β-半乳糖苷酶

17、活性評價細(xì)胞衰老,Real-time PCR檢測DDAH2、SIRT1 mRNA表達(dá),Western Blot檢測DDAH2蛋白表達(dá);HPLC檢測細(xì)胞上清ADMA水平。
　　 結(jié)果：
　　 BTM-0512能劑量依賴性降低2型糖尿病大鼠FBG和Hb1AC,改善HOME.IR和IAI,但對OGTT與IS沒有影響。
　　 在培養(yǎng)EPCs,BTM-0512能劑量依賴性抑制高糖誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,上調(diào)細(xì)胞DDAH2、SIRT1