非對(duì)稱性二甲基精氨酸抑制2型糖尿病大鼠心肌線粒體生物合成與ATP生成及其機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的：糖尿病是嚴(yán)重危害人們健康的常見病,糖尿病病人易并發(fā)心肌病或心衰,已成為糖尿病病人死亡的重要因?yàn)?。然?糖尿病心肌病的發(fā)生并不依賴冠心病及高血壓的存在,它的發(fā)病機(jī)制也不十分清楚。近年研究顯示,線粒體功能障礙與糖尿病心肌病密切相關(guān)。鑒于線粒體生物合成減少在糖尿病心肌線粒體功能障礙中的起始作用以及一氧化氮(NO)在線粒體生物合成中的重要調(diào)節(jié)作用,本研究先在2型糖尿病大鼠模型,揭示內(nèi)源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物非對(duì)稱性二甲基

2、精氨酸(ADMA)在糖尿病心肌線粒體生物合成障礙中的重要作用；再在培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞株(H9C2)細(xì)胞,研究ADMA對(duì)心肌細(xì)胞線粒體生物合成的直接作用；并從氧化應(yīng)激、NO生成減少或活性降低兩個(gè)方面,進(jìn)一步探討ADMA引起線粒體生物合成障礙的可能機(jī)制；同時(shí)研究抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸和NO合成的促進(jìn)劑羅格列酮對(duì)ADMA抑制大鼠心肌細(xì)胞線粒體生物合成的影響,為闡明糖尿病心肌線粒體生物合成抑制機(jī)制以及糖尿病心肌病的臨床防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。<

3、br>　　 方法：1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):采用給雄性SD大鼠高脂飼養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法制備2型糖尿病大鼠模型；用RT-PCR方法檢測(cè)大鼠心肌ADMA的主要代謝酶二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(DDAH)基因的轉(zhuǎn)錄,用高效液相色譜測(cè)定大鼠血漿中ADMA濃度,用比色法檢測(cè)大鼠心肌DDAH與NOS活性及NO代謝產(chǎn)物的含量以反映糖尿病大鼠心肌DDAH/ADMA/NOS/NO通路改變；檢測(cè)線粒體基因細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COXⅠ)與

4、核基因β-actin拷貝數(shù)的比值以反映心肌線粒體生物合成；檢測(cè)大鼠心肌ATP含量以反映線粒體功能；檢測(cè)大鼠心肌組織抗氧化酶SOD活性以反映心肌抗氧化能力的改變；用RT-PCR方法檢測(cè)過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α(PGC-1α)和解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的mRNA水平以探討2型糖尿病大鼠心肌線粒體生物合成抑制和ATP生成的可能機(jī)制。
　　 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):采用ADMA和高糖、高游離脂肪酸(油酸)孵育大鼠心肌細(xì)胞株(H

5、9C2)細(xì)胞48 h,觀察它們對(duì)大鼠心肌細(xì)胞線粒體生物合成的影響；采用RT-PCR檢測(cè)PGC-1α基因和UCP2基因的轉(zhuǎn)錄水平,同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞NOS及SOD活性以及細(xì)胞培養(yǎng)基中NO代謝產(chǎn)物和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)濃度；并選用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)、NO合成的促進(jìn)劑羅格列酮(RSG)預(yù)孵育細(xì)胞12 h,再與ADMA和高糖、高游離脂肪酸共同孵育細(xì)胞48 h,以探討ADMA引起線粒體生物合成障礙的可能機(jī)制。
　　 結(jié)

6、果：1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):與正常對(duì)照大鼠相比,2型糖尿病大鼠血清中ADMA濃度明顯升高；2型糖尿病大鼠心肌中ADMA的主要代謝酶DDAH1和DDAH2的基因轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào),這可能是由于糖尿病大鼠心肌組織中內(nèi)源性ADMA含量增加代償性上調(diào)其代謝酶基因表達(dá)所致；糖尿病大鼠心肌DDAH與NOS活性以及NO含量與正常對(duì)照組比較均有明顯降低。糖尿病大鼠心肌組織中抗氧化酶SOD活性也顯著低于正常大鼠。與正常對(duì)照大鼠比較,糖尿病大鼠心肌COXⅠ/β-actin

7、比值明顯降低,糖尿病大鼠心肌ATP含量也顯著低于正常對(duì)照組,表明糖尿病大鼠心肌線粒體生物合成抑制,ATP生成減少。經(jīng)相關(guān)分析顯示,2型糖尿病大鼠血清內(nèi)源性ADMA濃度升高與心肌線粒體生物合成抑制及線粒體ATP生成減少密切相關(guān)。進(jìn)一步研究表明,導(dǎo)致糖尿病大鼠心肌線粒體生物合成抑制和線粒體ATP生成減少可能與心肌組織NO生成減少、PGC-1α基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)、心肌抗氧化能力降低及UCP2基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)有關(guān)。
　　 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):采用30μ

8、mol/L ADMA處理心肌細(xì)胞48 h可以明顯降低心肌細(xì)胞線粒體DNA和ATP含量,并與高糖、高脂肪酸孵育作用相似,表明心肌線粒體生物合成抑制；同時(shí)ADMA和高糖、高脂肪酸孵育還下調(diào)PGC-1α基因轉(zhuǎn)錄、增加氧化應(yīng)激、上調(diào)UCP2轉(zhuǎn)錄水平以及減少NO生成；分別用NAC和RSG治療可以明顯改善ADMA及高糖、高脂肪酸所致心肌線粒體生物合成抑制和ATP生成減少。
　　 結(jié)論：本研究結(jié)果表明:①內(nèi)源性NOS抑制物ADM A濃度升高與