LIF對小鼠視網(wǎng)膜光感受器視錐細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：建立小鼠視網(wǎng)膜光損傷模型，探討白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)對小鼠視網(wǎng)膜光感受器視錐細(xì)胞光損傷的影響。
　　 方法：采用5000lux白色冷光源對BALB/c小鼠進(jìn)行6h(下午6:00到凌晨12:00)持續(xù)照射，建立小鼠視網(wǎng)膜光損傷模型。30只小鼠分為五組:①正常對照組10只、玻璃體腔注藥組10只（②右眼為玻璃體腔LIF注藥組;③左眼為玻璃體腔PBS注藥組）和光損傷+玻璃體腔

2、注藥組10只（④右眼為光損傷+玻璃體腔LIF注藥組;⑤左眼為光損傷+玻璃體腔PBS注藥組）。光照前2d給予玻璃體腔注藥，右眼玻璃體腔LIF（0.4μg/μl，1μl）注藥，左眼玻璃體腔PBS(0.01M，1μl)平衡緩沖液注射（作為自身對照）。(1)光照后7天，視網(wǎng)膜電流圖(electroretinogram，ERG)檢查分別采用白光、綠光及藍(lán)光三種不同光刺激對視網(wǎng)膜光感受器視錐細(xì)胞的功能進(jìn)行檢測;(2) ERG檢查后，運(yùn)用免疫熒光組織

3、化學(xué)通過M視錐細(xì)胞和S視錐細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白M-opsin和S-opsin對視網(wǎng)膜光感受器視錐細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)進(jìn)行檢測。
　　 結(jié)果：(1)在白光、綠光及藍(lán)光刺激下，與正常對照組ERG b波振幅相比，玻璃體腔LIF注藥組和玻璃體腔PBS注藥組均無明顯變化，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);光損傷+玻璃體腔LIF注藥組和光損傷+玻璃體腔PBS注藥組均明顯下降，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。同時(shí)，與光損傷+玻璃體腔LIF注藥

4、組ERG b波振幅相比，光損傷+玻璃體腔PBS注射組明顯下降，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。(2)與正常對照組M-opsin和S-opsin的數(shù)量和形態(tài)相比，玻璃體腔LIF注藥組和玻璃體腔PBS注藥組均無明顯變化;光損傷+玻璃體腔LIF注藥組和光損傷+玻璃體腔PBS注藥組M-opsin和S-opsin的數(shù)量均明顯下降，并且光損傷+玻璃體腔PBS注藥組M-opsin和S-opsin的形態(tài)均明顯受損。
　　 結(jié)論：5000lu

5、x白色冷光源對BALB/c小鼠進(jìn)行6h持續(xù)照射可對視網(wǎng)膜光感受器視錐細(xì)胞的功能和形態(tài)產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。玻璃體腔注射LIF對視網(wǎng)膜光感受器視錐細(xì)胞光損傷具有保護(hù)作用。
　　 第二章氧化損傷條件下STAT3、ERK1/2和AKT信號(hào)通路激活促進(jìn)661W細(xì)胞存活
　　 目的：研究過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)對鼠視網(wǎng)膜光感受器視錐細(xì)胞661W細(xì)胞株細(xì)胞活性的影響，并探討在氧化損傷條件下信號(hào)傳導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活

6、因子3（signal transducer and activator oftranscription3，STAT3）信號(hào)通道、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1 and2，ERK1/2)信號(hào)通道和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB(AKT)）信號(hào)通道對661W細(xì)胞株細(xì)胞活性的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)鼠視網(wǎng)膜光感受器視錐細(xì)胞661W細(xì)胞株。

7、(1)不同濃度H2O2（0，0.25，0.50，0.75，1mM）干預(yù)12h，采用MTT方法檢測661W細(xì)胞株細(xì)胞活性;(2)運(yùn)用不同濃度H2O2(0，0.005，0.01，0.05，0.5，1mM)干預(yù)661W細(xì)胞15min與1mM H2O2干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)(0，5，10，15，30min)，采用Westem blot方法檢測p-Tyr705-STAT3、 STAT3、p-ERK1/2、 ERK1/2、p-ser473-AKT和AKT蛋

8、白質(zhì)的表達(dá);(3)運(yùn)用50μM STAT3特異性抑制劑S3I201、50μM MEK1（ERK1/2直接上游）特異性抑制劑PD98059和20μMAKT抑制劑分別干預(yù)661W細(xì)胞1h，采用Western blot方法檢測細(xì)胞信號(hào)通路抑制劑對STAT3、ERK1/2和AKT信號(hào)通路的抑制作用。50μM S3I201、50μM PD98059或者20μM AKT抑制劑預(yù)處理1h后1 mM H2O2干預(yù)12h，采用MTT方法檢測信號(hào)通路抑制劑

9、對661W細(xì)胞株細(xì)胞活性的影響。
　　 結(jié)果：(1)不同濃度H2O2作用12h后，661W細(xì)胞株的細(xì)胞活性呈濃度依賴性下降，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);(2) H2O2誘導(dǎo)661W細(xì)胞STAT3、ERK1/2和AKT磷酸化，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);(3) S3I201、PD98059和AKT信號(hào)通道抑制劑預(yù)處理后，H2O2誘導(dǎo)的661W細(xì)胞STAT3、ERK1/2或AKT磷酸化分別受抑制，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

10、p＜0.05)。用S3I201、PD98059和AKT信號(hào)通道抑制劑分別抑制STAT3、ERK1/2或AKT信號(hào)通路后，661W細(xì)胞株細(xì)胞活性均明顯下降，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：H2O2可激活661W細(xì)胞STAT3、ERK1/2和AKT信號(hào)通路。氧化損傷條件下，STAT3、ERK1/2和AKT信號(hào)通路的激活是661W細(xì)胞存活所必需的。
　　 第三章氧化損傷條件下LIF通過激活STAT3信號(hào)通路促

11、進(jìn)661W細(xì)胞存活
　　 目的：研究氧化損傷條件下，LIF對661W細(xì)胞活性的影響及其作用機(jī)制。
　　 方法：體外培養(yǎng)鼠視網(wǎng)膜光感受器視錐細(xì)胞661W細(xì)胞株。(1)5ng/ml LIF預(yù)處理661W細(xì)胞1h后1mM H2O2干預(yù)12h，采用MTT方法檢測661W細(xì)胞株細(xì)胞活性;(2)5ng/ml LIF預(yù)處理661W細(xì)胞1h后1mM H2O2干預(yù)15min，采用Western blot方法檢測661W細(xì)胞p-Tyr705

12、-STAT、 STAT3、p-ERK1/2、 ERK1/2、p-Ser473-AKT和AKT蛋白質(zhì)的表達(dá)。5ng/ml LIF干預(yù)661W細(xì)胞1h，采用免疫熒光組織化學(xué)方法檢測661W細(xì)胞p-Tyr705-STAT、p-ERK1/2和p-Ser473-AKT蛋白質(zhì)的表達(dá)和定位;(3)50μM STAT3特異性抑制劑S3I201預(yù)處理661W細(xì)胞1h后5ng/ml LIF預(yù)處理1h，然后1mMH2O2干預(yù)12h，采用MTT方法檢測661W

13、細(xì)胞株細(xì)胞活性;(4)50μMS3I201預(yù)處理661W細(xì)胞1h后1mM H2O2干預(yù)15min，采用Westernblot方法檢測細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)和細(xì)胞周期蛋白E(cyclinE)蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)氧化損傷條件下，LIF可降低H2O2誘導(dǎo)的661W細(xì)胞死亡，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。(2)正常和氧化損傷條件下，LIF均只激活STAT3信號(hào)通道，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);

14、不激活ERK1/2和AKT信號(hào)通道，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。(3)氧化損傷條件下，S3I201減弱LIF的保護(hù)作用，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。(4)氧化損傷條件下，阻斷STAT3信號(hào)通道減少STAT3靶基因cyclin D1和cyclin E蛋白的表達(dá)，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：我們的研究表明LIF作為661W細(xì)胞一個(gè)新的存活因子，氧化損傷條件下通過激活STAT3信號(hào)通道及其靶基因