體外誘導大鼠脂肪干細胞向光感受器細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞分化的初步研究.pdf

1、第一部分：大鼠脂肪干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。 目的：分離、培養(yǎng)和鑒定大鼠的脂肪干細胞。 方法：Ⅰ型膠原酶分離大鼠脂肪干細胞，用貼壁篩選法，在含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過連續(xù)傳代使細胞純化后，用流式細胞儀檢測CD45、CD90、CD49d、CD106鑒定干細胞的表面抗原。 結果：上述方法可以獲得大量高純度的脂肪干細胞。原代脂肪干細胞表型檢測：CD45陽性率是1.6％，CD90是71.3％，C

2、D49d是7.8％，CD106是3.5％。從傳1代至傳5代，CD45陽性率是0.8％～9.3％，CD90是84.7％～94.8％，CD49d是16.8％～31.0％，CD106是3.5％。各代ADSCs中，CD49d的陽性率均高于CD106。 第二部分：大鼠脂肪干細胞經(jīng)體外誘導向光感受器細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞的分化。 目的：體外誘導脂肪干細胞向光感受器細胞和RPE細胞的分化，并對不同誘導條件進行比較。。 方法：

3、采用機械分離法獲得視網(wǎng)膜感覺神經(jīng)上皮細胞，以及Dispase消化法獲得RPE細胞，制備視網(wǎng)膜細胞提取液。用EGF、激活素A、?；撬帷⒁朁S酸和視網(wǎng)膜細胞提取液單獨誘導大鼠脂肪干細胞；用EGF+?；撬帷GF+視黃酸、?；撬?視黃酸、EGF+?；撬?視黃酸聯(lián)合誘導大鼠脂肪干細胞。用免疫熒光法和流式細胞儀鑒定被誘導的細胞的視紫紅質、CK和S—100的表達。免疫熒光法顯示脂肪干細胞和骨髓間充質干細胞表達視紫紅質、CK和S—100。流式細胞儀檢測

4、對照組和各種誘導組的視紫紅質、CK和S—100的表達，并計算誘導效應。 結果：視網(wǎng)膜細胞提取液誘導的部分細胞，呈卵圓形或梭形，細胞內(nèi)可見色素。在含有誘導劑的1％FBS/αMEM中，細胞生長速度減慢，細胞呈扁平多角形。脂肪干細胞的視紫紅質的誘導效應是17.5％～46.0％，CK的誘導效應是19.7％～79.3％，S—100的誘導效應是27.3％～50.7％。骨髓間充質干細胞的視紫紅質的誘導效應是55.9％～76.5％，CK的誘導效

5、應是39.4％～75.9％，S—100的誘導效應是25.4％～41.8％。 結論：改良的原代ADSCs分離和培養(yǎng)方法，可以獲得更多的細胞。采用貼壁篩選法，獲得高純度的ADSCs。采用機械分離法獲得視網(wǎng)膜感覺神經(jīng)上皮細胞，以及Dispase消化法獲得RPE細胞，可以制備全層視網(wǎng)膜細胞提取液，用于ADSCs誘導實驗。用EGF、激活素A、?；撬?、視黃酸和視網(wǎng)膜細胞提取液單獨誘導；用EGF+牛磺酸、EGF+視黃酸、?；撬?視黃酸、EGF