鼻咽纖維血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞比正常血管內(nèi)皮細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力.pdf

1、鼻咽纖維血管瘤,又稱青少年鼻咽纖維血管瘤(juyenile nasopharyngeal angiofibroma,JNA)是鼻咽部良性腫瘤中最常見的一種,約占總頭頸部腫瘤的0.5％,主要發(fā)生于14-25歲的青少年男性。盡管JNA組織學(xué)上呈良性表型,但其沒有包膜,而且具有局部侵襲和破壞性惡性表型,可以累及鼻腔、鼻咽部、鼻竇、翼腭窩、顳下窩、翼突以及前顱底組織等。
　　JNA沒有特異性的藥物治療手段,放射療法的使用尚存在爭議,外科手

2、術(shù)切除仍然是目前最常用的治療方法。近年來,隨著耳鼻喉科臨床治療手段的長足進(jìn)步,特別是術(shù)前栓塞和鼻內(nèi)鏡技術(shù)的使用,使得大部分患者獲得了較好的預(yù)后,但是JNA術(shù)后高復(fù)發(fā)率(可高達(dá)5096)仍是一個極大的挑戰(zhàn)。目前關(guān)于JNA術(shù)后高復(fù)發(fā)的原因和相關(guān)的臨床預(yù)測指標(biāo)研究甚少,可能與JNA向周圍顱底骨質(zhì)侵襲,手術(shù)難以徹底切除有關(guān)。如能闡明引起JNA局部侵襲及術(shù)后復(fù)發(fā)的因素及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制,將進(jìn)一步改善JNA患者的預(yù)后。
　　腫瘤血管生成與包括J

3、NA在內(nèi)的多種腫瘤生長和局部侵襲密切相關(guān)。但是目前基于JNA血管生成及其分子機(jī)制研究不多,特別是針對內(nèi)皮細(xì)胞本身的功能研究更少,關(guān)鍵在于缺乏直接來源于腫瘤標(biāo)本并可用于體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮工具細(xì)胞。本課題首先分析血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD105在JNA組織芯片(tissuemicroarray,TMA)微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義,進(jìn)一步通過免疫磁珠分選(magnetic activated cell sorting,MACS)人JNA的血管

4、內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),檢測腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞及正常血管內(nèi)皮細(xì)胞間的功能差異并探討其差異的分子機(jī)制,以期闡明導(dǎo)致JNA高復(fù)發(fā)的原因及可能機(jī)制,并以此尋找新的復(fù)發(fā)干預(yù)途徑,進(jìn)一步提高療效。
　　第一部分，血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD105在鼻咽纖維血管瘤組織芯片微血管中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的:通過構(gòu)建組織芯片并運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色的方法明確CD105蛋白在JNA微血管中的表達(dá),并分析其與JNA臨床病理特征以及復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。
　

5、　方法:通過免疫組織化學(xué)染色方法在一套獨(dú)立的組織芯片(包括70例JNA患者的腫瘤組織)中檢測了CD105的表達(dá)情況,進(jìn)行微血管計數(shù),并分析其與年齡、JNA手術(shù)史、手術(shù)方式、腫瘤分期、術(shù)中出血等臨床病理特征的關(guān)系,同時進(jìn)一步分析微血管密度(microvessel density,MVD)與JAN患者臨床病理參數(shù)及至復(fù)發(fā)時間(time to recurrence,TTR)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示,CD105僅表達(dá)

6、于血管內(nèi)皮細(xì)胞中,在間質(zhì)中未見明顯表達(dá)?？ǚ綑z驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)微血管數(shù)目高低與腫瘤復(fù)發(fā)顯著相關(guān)(P=0.013)。Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗(yàn)顯示,低微血管密度患者的TTR顯著高于高微血管密度患者(P=0.009)。多因素回歸模型結(jié)果也提示,微血管密度是一個決定7NA預(yù)后的獨(dú)立因素(P=0.01)。
　　結(jié)論:CD105染色的腫瘤微血管密度可以預(yù)測JNA患者術(shù)后復(fù)發(fā),提示血管生成在JNA發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中可能起重要

7、作用,有望成為JNA治療靶點(diǎn)和預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。同時,為將CD105做為分離JNA血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)記提供了臨床依據(jù)。
　　第二部分，人鼻咽纖維血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞分選、鑒定與培養(yǎng)
　　目的:分選、鑒定及傳代培養(yǎng)人鼻咽纖維血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　方法:采用抗CD105抗體交聯(lián)免疫磁珠,通過免疫磁珠分選法,對JNA組織進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞分選;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測陽性分選細(xì)胞的純度。通過細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測vonWillebran

8、dfactor(vWF,又稱Ⅷ因子)的表達(dá),并通過乙?；兔芏戎鞍讛z取實(shí)驗(yàn)及小管生成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證陽性分選細(xì)胞是否具有血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。
　　結(jié)果:流式檢測陽性分選細(xì)胞的CD105表達(dá)高達(dá)99％以上;細(xì)胞免疫化學(xué)檢測顯示陽性分選細(xì)胞中Ⅷ因子表達(dá)為陽性,超過95％的陽性分選細(xì)胞乙酰化低密度脂蛋白攝取實(shí)驗(yàn)陽性;分選細(xì)胞在基質(zhì)膠中可形成毛細(xì)管結(jié)構(gòu)。同時可將陽性分選細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)至10代以上,其內(nèi)皮細(xì)胞特性仍存在。
　　結(jié)論:通過免

9、疫磁珠分選(MACs)法,我們成功分選獲得高純度的CD105陽性鼻咽纖維血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞(CD105+juvenile nasopharyngeal angiofibroma-derived endothelial cell,CD105+JEC),并能夠成功傳代培養(yǎng),為后續(xù)研究提供了細(xì)胞平臺。
　　第三部分，鼻咽纖維血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能比較
　　目的:比較JNA組織中分離的CD105陽性內(nèi)皮細(xì)胞與人臍

10、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的功能差異。
　　方法:采用CyQUANT法增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)對比觀察兩種細(xì)胞體外的增殖、侵襲和遷移能力的異同;通過免疫熒光觀察細(xì)胞骨架蛋白肌動蛋白纖維(F-actin)的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位分布的差異,運(yùn)用Westernblot檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,

11、MMP-2)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體(Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)水平異同。
　　結(jié)果:增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD105+JEC的增殖能力低于HUVEC;而劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)及F-actin熒光染色顯示CD105+JEC的遷移和侵襲能力高于HUVEC;Westernblot結(jié)果顯示VEGFR1、p-MAPK、MMP-2在CD105+JNA血管內(nèi)皮細(xì)