小腦頂核調節(jié)免疫系統(tǒng)功能的中樞和外周途徑.pdf

1、目的：
　　我們實驗室以前的研究表明小腦頂核可參與調節(jié)淋巴細胞功能。由于小腦與免疫系統(tǒng)之間沒有直接的結構上的聯(lián)系，因此探討小腦調節(jié)免疫功能的途徑和機制對于更好地理解小腦的免疫調節(jié)功能具有重要的意義。下丘腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫調節(jié)中樞。為此，本研究一方面進一步揭示小腦頂核至下丘腦的神經(jīng)投射路徑及性質；另一方面，在上述研究的基礎上分別研究小腦頂核至下丘腦γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）能和谷氨酸

2、能神經(jīng)投射對淋巴細胞功能的影響，以探討小腦頂核調節(jié)免疫功能的中樞和外周途徑，進一步拓寬和加深對小腦神經(jīng)免疫調節(jié)的認識和理解。
　　方法：
　　1.單側小腦頂核內微量注射葡聚糖-德克薩斯紅（Texas red dextran amine, TRDA），順行追蹤頂核至下丘腦的神經(jīng)投射路徑及終止部位。單側下丘腦外側區(qū)（lateral hypothalamic area, LHA）內微量注射逆行追蹤劑紅色熒光金（Fluoro-Rub

3、y, FR），結合GABA和谷氨酸免疫熒光組織化學染色，進一步確定頂核至下丘腦投射的性質。
　　2.雙側小腦頂核內微量注射GABA降解酶—GABA轉氨酶的抑制劑氨已烯酸（vigabatrin,VGB）或GABA合成酶—谷氨酸脫羧酶的抑制劑3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid,3-MP），并以未作任何處理的空白大鼠和雙側小腦頂核注射等量生理鹽水的大鼠作為對照。注射后第3天，用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carb

4、oxyl fluorescein succinimidyl ester, CFSE）和抗CD3抗體流式雙標技術檢測T淋巴細胞對刀豆蛋白A（concanavalin A, Con A）刺激的增殖反應；用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測血清中抗綿羊紅細胞（sheep red blood cells, SRBC）特異性 IgM抗體水平；動物于第6天加強注射藥物，3天后用CA

5、M/EH-1流式雙標技術檢測脾臟自然殺傷（natural killer, NK）細胞殺傷腫瘤靶細胞YAC-1的活性。在檢測淋巴細胞功能的同時，用FR逆行追蹤結合GABA免疫組化染色檢測頂核至LHA投射中GABA能神經(jīng)元數(shù)目的變化，并用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography, HPLC）檢測下丘腦中GABA的含量變化。
　　3.大鼠用小牛血清白蛋白（bovine serum al

6、bumin, BSA）進行免疫。免疫后第3天，雙側小腦頂核內微量注射谷氨酸合成酶—谷氨酰胺酶的抑制劑6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（6-diazo-5-oxo-L-norleucine, DON），同時雙側 LHA或丘腦腹外側核（ventrolateral thalamic nuclei, VL）內微量注射谷氨酸膜轉運體抑制劑蘇式-3-羥基天冬氨酸（D,L-threo-β-hydroxyaspartic acid, THA）。動物飼養(yǎng)

7、3天，用抗CD3，CD4， CD8，CD45RA和NKR-P1A抗體標記流式檢測外周血中T細胞及其亞群，B細胞和NK細胞的百分比變化；用CD3/CD25和CD3/CFSE流式雙標技術分別檢測腸系膜淋巴結T細胞對Con A刺激的活化和增殖能力；用real-time PCR法檢測淋巴結T細胞中細胞因子IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-5，IL-10，TGF-β，IL-22，IL-17 mRNA的表達及用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中細胞

8、因子IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-10，TGF-β，IL-22， IL-17的水平。此外，大鼠B細胞抗BSA IgM和IgG抗體生成能力及脾臟NK細胞的殺傷活性也分別用 ELISA法及流式細胞術進行檢測。在檢測上述淋巴細胞功能的同時，同樣用FR逆行追蹤結合谷氨酸免疫組化染色檢測頂核至LHA投射中谷氨酸能神經(jīng)元數(shù)目的變化，以及用HPLC法檢測下丘腦及丘腦組織中谷氨酸含量的變化。
　　4.注射DON及THA后第3天，用ELIS

9、A法檢測血清中促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone,ACTH），皮質醇（cortisol），促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone,TSH），三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine,T3）及甲狀腺素（thyroxin,T4）的水平，用HPLC法進行檢測外周免疫器官脾臟及淋巴結中去甲腎上腺素（norepinephrine,NE）的含量變化。
　　結果：

10、r>　　1.頂核神經(jīng)元發(fā)出的TRDA陽性纖維，在小腦上腳中走行，至小腦上腳交叉處交叉至對側，并進入下丘腦，主要終止于LHA。在LHA注射逆行追蹤劑FR，標記的陽性纖維逆行穿行于小腦上腳交叉，并可到達小腦頂核。結合免疫熒光組織化學染色發(fā)現(xiàn)頂核投射到LHA的神經(jīng)元既有GABA能又有谷氨酸能。
　　2.雙側頂核注射VGB導致腸系膜淋巴結T細胞對Con A誘導的增殖反應，血清中抗SRBC IgM抗體水平及脾臟NK細胞殺傷腫瘤YAC-1靶細

11、胞的殺傷活性均低于空白組及頂核注射生理鹽水的對照組。而雙側頂核注射3-MP，可導致相反的變化。與此同時，頂核注射VGB可顯著增加頂核至LHA投射中GABA能神經(jīng)元的數(shù)目和下丘腦中GABA的含量，而頂核注射3-MP，頂核至LHA投射中GABA能神經(jīng)元的數(shù)目和下丘腦中GABA的含量均降低。
　　3.雙側頂核注射DON后，外周血中CD3+T細胞，CD3+CD4+T細胞數(shù)目及CD4/CD8比值均低于空白組和頂核注射生理鹽水的對照組，而CD

12、3+CD8+T細胞數(shù)目沒有顯著變化；腸系膜淋巴結T細胞的活化和增殖能力降低；淋巴結T細胞致炎細胞因子IL-2，IFN-γ，IL-17，IL-22的mRNA表達及在細胞培養(yǎng)上清中的含量均顯著低于空白組和生理鹽水對照組，而抗炎細胞因子IL-4，IL-10，IL-5，TGF-β的mRNA表達和培養(yǎng)上清中IL-4，IL-10，TGF-β的含量沒有顯著變化。另外，外周血中B細胞數(shù)目及血清中抗BSA IgM和IgG水平也明顯下降。外周血中NK細胞數(shù)

13、目及脾臟NK細胞殺傷活性也明顯降低。與此同時，頂核注射DON后，頂核至LHA投射中谷氨酸能神經(jīng)元的數(shù)量及下丘腦中谷氨酸的含量也降低。頂核注射DON聯(lián)合LHA注射THA可使上述外周血中CD3+及CD3+CD4+T細胞數(shù)目和CD4/CD8比值，淋巴結T細胞的活化和增殖，致炎細胞因子的mRNA表達和細胞培養(yǎng)上清中的含量都顯著高于單獨頂核注射DON組。此外，外周血中B細胞數(shù)目及血清中抗BSA抗體水平，外周血中NK細胞數(shù)目及脾臟NK細胞殺傷活性也

14、均高于單純頂核注射DON組。同時下丘腦中谷氨酸的含量也比單純頂核注射DON組有所升高。頂核至VL也有直接的谷氨酸能神經(jīng)投射，而頂核注射DON的同時VL注射THA，雖然丘腦中谷氨酸的含量較單純頂核注射DON有所升高，但上述T，B，NK細胞的數(shù)目和功能降低沒有顯著改變。
　　4.雙側頂核注射DON可導致脾臟和淋巴結中NE含量高于空白組和生理鹽水對照組，聯(lián)合LHA注射THA后脾臟和淋巴結中NE含量較單純注射DON組有所降低。動物注射DO

15、N及THA，血清中ACTH，皮質醇，TSH，T3及T4的水平?jīng)]有顯著變化。
　　結論：
　　1.小腦頂核發(fā)出直接的神經(jīng)纖維投射至下丘腦，主要終止于LHA；這些神經(jīng)投射中有GABA能和谷氨酸能纖維。
　　2.小腦頂核的GABA能神經(jīng)元調節(jié)T、B和NK細胞的功能，此調節(jié)作用由頂核至下丘腦的GABA能神經(jīng)投射所介導。
　　3.小腦頂核的谷氨酸能神經(jīng)元調節(jié)T、B和NK細胞的數(shù)目和功能，這種調節(jié)作用由頂核投射至下丘腦而不是