轉(zhuǎn)gshB基因油菜毛狀根的誘導(dǎo).pdf

1、目的：重金屬鎘(Cd)是生物毒性較強(qiáng)的重金屬元素之一，它會(huì)隨工業(yè)“三廢”排放到土壤中，并且在土壤一植物系統(tǒng)中遷移，因此Cd污染土壤的修復(fù)引起了世界各國(guó)的關(guān)注。利用植物修復(fù)技術(shù)進(jìn)行Cd污染土壤的修復(fù)具有良好的應(yīng)用潛力，而Cd超富集植物是這一技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵。因此加強(qiáng)對(duì)Cd超富集植物的研究是推動(dòng)植物修復(fù)Cd污染環(huán)境實(shí)際應(yīng)用的基礎(chǔ)。本文選擇生長(zhǎng)快、易獲得的Cd超富集植物油菜（Brassica campestris L.）作為研究材料，選擇編碼谷

2、酰半胱氨酸巰基合成酶(GS)的gshB基因作為外源目的基因，希望利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因的油菜毛狀根體系，為研究植物根系與Cd的相互作用提供簡(jiǎn)便可靠的實(shí)驗(yàn)體系。
　　方法：發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)常用的方法之一，利用野生型發(fā)根農(nóng)桿菌和攜帶gshB基因的發(fā)根農(nóng)桿菌分別轉(zhuǎn)化油菜，獲得野生型油菜毛狀根和轉(zhuǎn)gshB基因油菜毛狀根。為了實(shí)現(xiàn)油菜毛狀根的誘導(dǎo)并獲得較高的轉(zhuǎn)化率，利用正交試驗(yàn)(L8(27))的方法，考查了發(fā)根農(nóng)桿菌菌

3、種(ATCC11325、ATCC15834)、油菜外植體（子葉、莖段）、侵染時(shí)間(10 min、30 min)、激素（2，4-D、NAA）四因素對(duì)油菜毛狀根誘導(dǎo)的影響。利用熱激法將構(gòu)建的重組pRI101-gshB質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325中，獲得改造的含有g(shù)shB目的基因的ATCC11325菌種。利用PCR和RT-PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化的毛狀根進(jìn)行鑒定，確定毛狀根轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因rolC和目的基因gshB已經(jīng)整合到油菜毛狀根組織的DN

4、A中。對(duì)油菜毛狀根進(jìn)行初步的Cd脅迫應(yīng)激響應(yīng)研究。將轉(zhuǎn)gshB基因毛狀根和野生型毛狀根分別置于不含Cd和含50μmol/L Cd的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)，7d后取樣測(cè)定毛狀根的生物量、毛狀根中過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化、丙二醛(MDA)的含量，并且通過PI染色檢測(cè)Cd脅迫下的植物細(xì)胞膜的通透性。
　　結(jié)果：正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果顯示，菌種和侵染時(shí)間的交互作用、外植體種類對(duì)油菜毛狀根的誘導(dǎo)達(dá)到顯著水平。正

5、交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325對(duì)預(yù)培養(yǎng)48 h的油菜子葉進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時(shí)間10 min，同時(shí)加入0.3 mg/L的2，4-D激素時(shí)，油菜毛狀根的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到73％。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中的rolC基因已經(jīng)插入并整合到油菜的植物基因組中，表明成功誘導(dǎo)出了油菜毛狀根體系。利用正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得的油菜毛狀根最佳誘導(dǎo)條件，用含有重組pRI101-gshB質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325侵染油菜子葉，誘導(dǎo)出了轉(zhuǎn)g

6、shB基因的油菜毛狀根。PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)gshB基因毛狀根DNA基因組中含有960 bp左右的gshB基因片段，證明目的片段已經(jīng)整合到油菜核基因組中。采用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄油菜RNA獲得cDNA序列，PCR結(jié)果顯示cDNA序列中含有960 bp的目的片段，表明目的基因已經(jīng)在毛狀根中轉(zhuǎn)錄，說(shuō)明成功獲得了轉(zhuǎn)gshB基因的油菜毛狀根。
　　結(jié)論：毛狀根的Cd脅迫應(yīng)激響應(yīng)的實(shí)驗(yàn)表明，50μmol/L的Cd對(duì)油菜野生型毛狀根和轉(zhuǎn)gshB毛狀

7、根的生長(zhǎng)都有一定的抑制作用;油菜野生型毛狀根和轉(zhuǎn)gshB毛狀根中SOD、POD酶的活性都有一定程度的升高，MDA的含量都增大，PI染色程度加深。同時(shí)，在50μmol/L的Cd處理下，轉(zhuǎn)gshB毛狀根中SOD和POD酶活性的升高比例高于野生型毛狀根，MDA的量和PI染色程度都低于野生型毛狀根。這可能是由于轉(zhuǎn)入的gshB基因提高了油菜毛狀根螯合Cd的能力，減輕了毛狀根被Cd毒害的程度。轉(zhuǎn)gshB基因油菜毛狀根體系的建立，可為后續(xù)利用油菜毛狀