道地藥材研究模型“丹參毛狀根”的評(píng)價(jià)研究.pdf

1、作為中醫(yī)藥的精髓，藥材的道地性既有來(lái)源于歷史和文化的屬性，又涉及到遺傳、環(huán)境及生產(chǎn)實(shí)踐等方方面面。從生物學(xué)上說(shuō)“道地藥材”的形成是基因型與環(huán)境之間相互作用的產(chǎn)物，可用公式表示：表型=基因型+環(huán)境飾變。道地藥材是一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)，它的每一個(gè)因素及其相互作用不可能都被同時(shí)考察，研究中必須有所取舍，對(duì)研究對(duì)象降階降維，才有可能取得突破。環(huán)境因子究竟是如何通過(guò)修飾道地藥材的基因型而發(fā)生作用的，生態(tài)因子與道地藥材次生代謝產(chǎn)物積累的有著怎樣的關(guān)系，至今

2、缺少直接和系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。至此，科學(xué)模型因其具有簡(jiǎn)化復(fù)雜研究對(duì)象的特點(diǎn)，開(kāi)始引起道地藥材研究者的關(guān)注，構(gòu)建道地藥材研究模型（載體），成為道地藥材生物學(xué)研究的關(guān)鍵。
　　 模型在生物學(xué)中的應(yīng)用相當(dāng)廣泛。通過(guò)在基本原型的基礎(chǔ)上建立相關(guān)的模型，并運(yùn)用相應(yīng)的模型分析解釋生物學(xué)現(xiàn)象、揭示生物本質(zhì)規(guī)律特征，研究某種動(dòng)態(tài)生命系統(tǒng)中各種因子之間相互關(guān)系。作為現(xiàn)代生命科學(xué)研究不可缺少的重要手段，模型和模型方法很早就已經(jīng)滲透到生命科學(xué)研究的各個(gè)環(huán)節(jié)

3、，例如用于基因工程研究的模式物種，用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型等。
　　 毛狀根培養(yǎng)是80年代發(fā)展起來(lái)的基因工程和細(xì)胞工程相結(jié)合的一項(xiàng)新技術(shù)，它是將發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒中含有的T-DNA轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞的DNA上，誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生毛狀根。毛狀根作為一種有效的長(zhǎng)期保持物種優(yōu)良性狀的方式，越來(lái)越多的被人們作為實(shí)驗(yàn)材料，同時(shí)獲取次生代謝產(chǎn)物。毛狀根具有生長(zhǎng)速度快，且不受氣候、病蟲(chóng)害、地理和季節(jié)的限制等特點(diǎn)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)外目前己對(duì)29科5

4、2種藥用植物進(jìn)行了毛狀根誘導(dǎo)的研究，建立了長(zhǎng)期的毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)，獲得次生代謝產(chǎn)物。
　　 本論文針對(duì)目前道地藥材生物學(xué)本質(zhì)研究中需要解決的問(wèn)題，在本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展工作的基礎(chǔ)上，選取丹參毛狀根作為研究對(duì)象，對(duì)其是否具備道地藥材研究模型的特性進(jìn)行了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)研究。即毛狀根到底能不能作為模型來(lái)研究道地藥材?能不能再現(xiàn)原植物藥材的特性，是否能作為穩(wěn)定的可重復(fù)的研究工具等。
　　 該模型的評(píng)價(jià)研究，涉及到植物化學(xué)、分子生物學(xué)、藥理學(xué)等

5、許多層面。主要包括三個(gè)方面：①再現(xiàn)性，作為研究道地藥材的模型要考察毛狀根和其原型（即原藥材）之間的相似性，包括化學(xué)成分，毒性以及藥效等，來(lái)闡明毛狀根是否具有再現(xiàn)原藥材的特性。②穩(wěn)定性，毛狀根的核DNA的穩(wěn)定性、rol基因遺傳穩(wěn)定性、化學(xué)成分穩(wěn)定性等。③實(shí)用性，在證明毛狀根模型具有穩(wěn)定性和再現(xiàn)性的基礎(chǔ)上，對(duì)其作為模型的實(shí)用性進(jìn)行了研究，考察毛狀根是否便于取材，是否具備優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)物性，作為模型是否易于建立和使用。
　　 1.丹參毛狀

6、根模型的再現(xiàn)性研究（與原植物的相似性）
　　 1.1化學(xué)成分的相似性選取藥典中的指標(biāo)成分丹參酮ⅡA和丹酚酸B，對(duì)丹參毛狀根和河北丹參藥材進(jìn)行了含量測(cè)定，丹參藥材中丹參酮ⅡA含量為0.12％，丹酚酸B含量為5.4％；各個(gè)批次的毛狀根丹參酮ⅡA的含量在0.04％～0.10％之間，平均值與藥材相比較低；丹酚酸B的含量在3.21％～7.25％，平均值與藥材相比較高。同時(shí)，用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版軟件進(jìn)行相似度分析，對(duì)

7、毛狀根與藥材的指紋圖譜也進(jìn)行了比較，相似度在0.948以上，說(shuō)明丹參毛狀根的化學(xué)成分組成與2個(gè)產(chǎn)地（河北靈壽，四川中江）的丹參藥材相比差異不顯著。由此可見(jiàn)，丹參毛狀根與丹參藥材具有相似的化學(xué)成分。
　　 1.2急性毒性丹參毛狀根提取物L(fēng)D50為63.94g生藥/kg，95％可信區(qū)間為（58.82～69.51）g生藥/kg。按公斤體重計(jì)算相當(dāng)于成人日攝入量（丹參臨床人用劑量為9～15ed日，0.25g生藥/kg）的255.76倍。

8、結(jié)果表明，丹參毛狀根最大無(wú)毒劑量已超過(guò)人臨床用藥量的100倍。
　　 1.3藥效的相似性丹參根為傳統(tǒng)的“活血化瘀”中藥。其各種制劑應(yīng)用于冠心病與心血管病治療收到了良好的效果。本實(shí)驗(yàn)從整體、器官以及細(xì)胞三個(gè)水平上觀察丹參毛狀根對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。①整體實(shí)驗(yàn)表明，丹參毛狀根組能顯著降低缺血再灌注所致VT，VF的發(fā)生率，降低血漿LDH，MDA含量，提高SOD活性；與丹參藥材相比無(wú)顯著性差異。②離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹參毛狀根能夠增

9、加冠脈流量，不但降低心律失常的發(fā)生率，而且推遲心律失常的發(fā)生時(shí)間，縮短持續(xù)時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間，對(duì)LDH，MDA和SOD的釋放有明顯的改善作用，結(jié)果提示丹參毛狀根處理對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷可能具有保護(hù)作用；與丹參藥材相比無(wú)顯著性差異。⑨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，丹參毛狀根可較顯著增加H/R心肌細(xì)胞的存活率，降低MDA含量，提高SOD活性。各組隨劑量增大LDH，MDA含量減少，SOD活性增加，丹參毛狀根可拮抗大鼠心肌細(xì)胞H/R損傷，對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H/

10、R損傷可能具有保護(hù)作用；與丹參藥材相比無(wú)顯著性差異。上述研究表明，丹參毛狀根與丹參藥材對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用相當(dāng)。
　　 2.丹參毛狀根模型的穩(wěn)定性研究2.1核DNA的穩(wěn)定性通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)丹參毛狀根核DNA濃度的分析，選取大豆作為內(nèi)參物，結(jié)果表明所選取的5批丹參毛狀根樣品，核DNA含量平均為0.18pg/2C，基因組大小平均為87.8Mbp，RSD為6.6％，核DNA的濃度比較穩(wěn)定。2.2rol基因的穩(wěn)定性從隨機(jī)培養(yǎng)的

11、丹參毛狀根中任選10批，提取新鮮組織的DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，外源基因rolA在10批樣品的基因組DNA中均可以檢測(cè)到，并將rolA基因作為目的基因進(jìn)行了回收測(cè)序與GeneBank登錄序列（X12579）的同源性為100％。由此可以說(shuō)明10個(gè)批次的丹參毛狀根樣品中rol基因是穩(wěn)定的。
　　 2.3化學(xué)成分的穩(wěn)定性通過(guò)對(duì)丹參毛狀根的指紋圖譜研究，對(duì)其化學(xué)成分的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004

12、A版軟件進(jìn)行相似度分析，從計(jì)算結(jié)果可以看出，10批毛狀根的相似度均在0.970以上，說(shuō)明不同批次丹參毛狀根樣品間化學(xué)成分組成的差異不顯著。同時(shí)，通過(guò)對(duì)不同批次的丹參毛狀根的生長(zhǎng)情況的分析表明，不同批次生長(zhǎng)率無(wú)顯著性差異，比較穩(wěn)定。
　　 3.丹參毛狀根模型的實(shí)用性研究3.1丹參毛狀根的生長(zhǎng)周期研究6，7-V培養(yǎng)基上培養(yǎng)丹參毛狀根，分別在第2，4，6，8，10周收獲，測(cè)定其生長(zhǎng)量。高效液相色譜法測(cè)定丹參毛狀根中丹參酮ⅡA和丹酚酸B

13、的含量。在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的毛狀根，收獲時(shí)應(yīng)選擇6周比較合適，此時(shí)毛狀根的增長(zhǎng)倍數(shù)大，有效成分相對(duì)來(lái)說(shuō)也比較高。由此可見(jiàn)，丹參毛狀根培養(yǎng)周期短，6～8周即可收獲，具有快速繁殖的特性，并能迅速積累次生代謝產(chǎn)物。
　　 3.2礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)和有效成分積累的影響本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在6，7-V培養(yǎng)基的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素配方基礎(chǔ)上進(jìn)行加減，深入研究了培養(yǎng)基中氮、鉀、鐵、鎂4種單一礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的濃度，對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)和有效成分積累的影響。結(jié)

14、果表明，氮元素對(duì)毛狀根的生長(zhǎng)影響最大，其次是鉀元素。鐵元素和鎂元素對(duì)丹參毛狀根的生長(zhǎng)量影響不大。從有效成分含量的積累來(lái)看，低氮以及完全處理組的鐵和鎂元素有利于丹參酮ⅡA的累積。高氮，高鉀有利于丹酚酸B的積累。培養(yǎng)基中這4種元素濃度的改變都會(huì)對(duì)毛狀根產(chǎn)生不同程度的刺激，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)和有效成分的積累，由此證明丹參毛狀根對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素的刺激具有靈敏性，因此，可以用毛狀根作為模型進(jìn)行更深一步的道地產(chǎn)區(qū)環(huán)境因子變化的分析研究。
　　 結(jié)

15、論
　　 本論文的研究結(jié)果表明：丹參毛狀根具有良好的再現(xiàn)原藥材的特性，可以替代原藥材作為研究模型，各個(gè)批次遺傳、化學(xué)比較穩(wěn)定，取材方便，生長(zhǎng)繁殖快，具有優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)物性，作為模型具有一定的實(shí)用性。
　　 通過(guò)對(duì)丹參毛狀根的評(píng)價(jià)研究，認(rèn)為毛狀根可以作為研究模型。用毛狀根為模型，可以以道地藥材表型與生境及基因型的相互關(guān)系為切入點(diǎn)，深入研究道地藥材對(duì)環(huán)境的響應(yīng)，基因的功能、表達(dá)的調(diào)控機(jī)制等。
　　 本論文首次提出道地藥材