LPAR3對(duì)人類子宮內(nèi)膜容受性調(diào)控的研究.pdf

1、人類胚胎植入是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中胚胎和子宮內(nèi)膜互相作用，在一段非常短的時(shí)期共同作用完成胚胎著床。一個(gè)成功的植入過(guò)程需要三個(gè)重要的條件:優(yōu)質(zhì)的胚胎、良好的子宮內(nèi)膜容受性以及胚胎和子宮內(nèi)膜的同步發(fā)育。子宮內(nèi)膜僅在一段十分短暫的時(shí)間內(nèi)具有接受胚胎的能力，這一時(shí)期叫做“著床窗口期”。子宮內(nèi)膜的容受性受到多種生物信號(hào)的調(diào)控，包括:特殊的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、磷脂分子、細(xì)胞粘附因子以及轉(zhuǎn)錄因子等。這些生物信號(hào)受女性甾體激素、前列腺素和肽

2、類激素的調(diào)節(jié)，它們的變化會(huì)造成子宮內(nèi)膜容受性的改變，導(dǎo)致胚胎植入率和妊娠率的下降。
　　 溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)是一種具有多生物效應(yīng)的生長(zhǎng)因子。它可以調(diào)控細(xì)胞的生存、增殖、分化、抑制細(xì)胞間的縫隙連接和改變細(xì)胞骨架的重新排列。LPA在生殖方面也起到了重要的調(diào)控作用，包括刺激卵子的成熟、調(diào)節(jié)2～4卵裂球的胚胎向囊胚的轉(zhuǎn)化、影響胚胎在輸卵管的運(yùn)輸。LPA主要依靠細(xì)胞外基質(zhì)的溶血磷脂酶D水解磷脂

3、生成，也可以由活化的血小板、紅細(xì)胞、有絲分裂后的神經(jīng)元細(xì)胞、卵巢和宮頸癌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌產(chǎn)生。LPA通過(guò)G偶聯(lián)蛋白受體LPAR1-4發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。敲除LPAR1和LPAR2的雌性小鼠生育能力正常，但是敲除LPAR3基因的雌性小鼠生育能力發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為胚胎植入空間的改變、胚胎纏繞以及種植時(shí)間延遲。在小鼠交配后的2.5d，小鼠子宮內(nèi)膜上LPAR3的表達(dá)開(kāi)始上升，在圍植入期即交配后的3.5d表達(dá)達(dá)到頂峰，然后在交配后4.5

4、d下降恢復(fù)到基礎(chǔ)水平直至分娩后。目前對(duì)LPAR3在人類子宮內(nèi)膜容受性方面的研究很少，僅僅知道反復(fù)植入失敗的患者和子宮內(nèi)膜異位癥的患者在他們?cè)陆?jīng)周期的分泌期LPAR3在其子宮內(nèi)膜上的表達(dá)較正常婦女低。
　　 在控制性超促排卵（Controlled ovarian hyperstimulation，COH）中，由于為了在一個(gè)促排卵周期中同時(shí)得到多個(gè)發(fā)育的成熟卵子，因而使用了大量的促排卵藥物。長(zhǎng)效長(zhǎng)方案是目前應(yīng)用的較多的一種促排卵方案

5、，該方案可以獲得優(yōu)質(zhì)的卵子，受精率和優(yōu)胚率都比較高，但是胚胎的植入率比較低。分析原因，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由于促排卵藥物的使用造成體內(nèi)產(chǎn)生超生理濃度的激素，從而干擾了子宮內(nèi)膜的內(nèi)環(huán)境，降低了子宮內(nèi)膜的容受性。因此，找到子宮內(nèi)膜容受性下降的原因并找到解決的方法，可以提高IVF的妊娠率，具有很好的臨床意義。至今，還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道人類長(zhǎng)方案促排卵的患者子宮內(nèi)膜上LPAR3的表達(dá)方式。
　　 多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary s

6、yndrome，PCOS）患者由于體內(nèi)內(nèi)分泌紊亂，造成雌孕激素分泌異常和促黃體生成素(LH)的升高，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜上影響子宮內(nèi)膜容受性的因素表達(dá)異常，從而降低了PCOS患者子宮內(nèi)膜的容受性。目前對(duì)PCOS患者的子宮內(nèi)膜容受性的研究主要集中在對(duì)甾體激素及其受體、整合素、基質(zhì)金屬蛋白酶、同源框基因等因子，對(duì)于目前新近發(fā)現(xiàn)在生殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用的LPAR3的研究甚少，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。此外在我們研究的臨床部分，我們?cè)诟纳芇COS患者子宮內(nèi)膜容

7、受性的原理的基礎(chǔ)上，采用了降調(diào)節(jié)人工周期子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備的方法，目的是找到一種有效的提高PCOS患者的子宮內(nèi)膜的容受性的方法。
　　 本研究主要利用RT-PCR，Western blot和免疫組化等技術(shù)研究了正常婦女月經(jīng)周期、IVF促排卵患者圍著床期以及PCOS患者月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜LPAR3的表達(dá)情況和差異。初步說(shuō)明了LPAR3在子宮內(nèi)膜容受性建立過(guò)程中的重要作用。研究分為四個(gè)部分，前三個(gè)部分為實(shí)驗(yàn)部分，最后一個(gè)部分為臨床部分，實(shí)

8、驗(yàn)方法和結(jié)果如下:
　　 第一部分 LPAR3在正常婦女月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜上的表達(dá)
　　 目的:研究溶血磷脂酸受體3（Lysophosphatidic acid receptor3，LPAR3）mRNA及其蛋白在正常婦女月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜上的表達(dá)規(guī)律。
　　 方法:采用RT-PCR，Western blot和免疫組化法，檢測(cè)LPAR3 mRNA和蛋白在正常婦女月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜上的表達(dá)規(guī)律。
　　 結(jié)果:<

9、br>　　 1.在整個(gè)人類月經(jīng)周期中均可在子宮內(nèi)膜組織中檢測(cè)到LPAR3mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 2.在整個(gè)增生期LPAR3 mRNA和蛋白的表達(dá)呈低表達(dá)狀態(tài)，在早分泌期LPAR3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，并且達(dá)到峰值，但是在中分泌期LPAR3 mRNA和蛋白的表達(dá)驟然下降，恢復(fù)到增生期水平。但在晚分泌期LPAR3 mRNA和蛋白表達(dá)又上升，逐級(jí)恢復(fù)到早分泌期水平。
　　 3.在早增生期LPAR3蛋白主要分布在

10、子宮內(nèi)膜的腔上皮、腺上皮的細(xì)胞漿中。在中晚增生期雖然間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞漿中LPAR3的陽(yáng)性著色范圍擴(kuò)大，但仍是主要在子宮內(nèi)膜的腺上皮和腔上皮細(xì)胞的胞漿中呈陽(yáng)性表達(dá)。在早分泌期腺上皮和子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性免疫染色，間質(zhì)細(xì)胞也出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。在中分泌期LPAR3在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的表達(dá)驟然下降，主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜腔上皮的細(xì)胞漿中，但是表達(dá)降低呈弱陽(yáng)性反應(yīng)。在晚分泌期LPAR3主要在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中和血管上表達(dá)，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。在

11、子宮內(nèi)膜的腔上皮和腺上皮上呈弱陽(yáng)性表達(dá)。
　　 4.在早中增生期主要分泌雌激素(estrogen，E)，LPAR3處于低表達(dá)狀態(tài);在晚增生期成熟卵泡的顆粒細(xì)胞在黃體生成素(luteinizinghormone，LH)排卵高峰的作用下，開(kāi)始分泌孕酮(progestin，P)，排卵后P逐漸增加，E分泌下降，子宮內(nèi)膜上LPAR3的表達(dá)開(kāi)始在早分泌期增加。在中分泌期E水平又增加，LPAR3在子宮內(nèi)膜上的表達(dá)下降。在晚分泌期E水平下降，L

12、PAR3在子宮內(nèi)膜上的表達(dá)開(kāi)始上升。
　　 結(jié)論:
　　 1.LPAR3在人類月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜上呈周期性的變化，在人類的圍著床期LPAR3的表達(dá)達(dá)到頂峰，這種變化規(guī)律揭示LPAR3可能參與了子宮內(nèi)膜容受性的建立，可作為預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜容受性的分子參考指標(biāo)。
　　 2我們把月經(jīng)周期中E、LH和P的表達(dá)規(guī)律和LPAR3在子宮內(nèi)膜上的表達(dá)方式相比較，我們推測(cè)LPAR3可能受到LH和P的正向調(diào)控，而E可能對(duì)這種正向調(diào)控有抑

13、制作用（見(jiàn)下圖）。
　　 第二部分 GnRHa長(zhǎng)方案促排卵對(duì)圍著床期人類子宮內(nèi)膜上LPAR3表達(dá)的影響
　　 目的:研究GnRHa/rFSH/hCG控制性超促排卵(COH)對(duì)圍著床期人類子宮內(nèi)膜溶血磷脂酸受體3（LPAR3）表達(dá)的影響。
　　 方法:將研究對(duì)象分為自然周期對(duì)照組(NC組)和COH實(shí)驗(yàn)組，用RT-RCR和Western blot方法觀察兩組排卵后3d～6d子宮內(nèi)膜上LPAR3mRNA和蛋白的表達(dá)變化

14、。
　　 結(jié)果:
　　 1.NC組子宮內(nèi)膜中LPAR3的表達(dá)在排卵后d4達(dá)到頂峰，COH組子宮內(nèi)膜LPAR3的表達(dá)高峰較NC組要提前1d，即在排卵后d3達(dá)到頂峰。
　　 2.COH組子宮內(nèi)膜LPAR3在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平均低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 3.COH組血清中E2和P濃度水平在相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)均高于NC對(duì)照組，E2/P比值也高于NC對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　

15、　 結(jié)論:
　　 1.GnRHa控制性超促排卵可能通過(guò)改變子宮內(nèi)膜LPAR3表達(dá)的水平和時(shí)序變化，一方面降低了子宮內(nèi)膜的容受性，同時(shí)一方面也使子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育不同步從而降低胚胎的著床率。這提示我們可能通過(guò)改善目前移植胚胎的時(shí)間，達(dá)到子宮內(nèi)膜和胚胎發(fā)育同步，從而提高IVF妊娠率。
　　 2.可能由于在GnRHa控制性超促排卵中超生理劑量的E2和P水平，以及不協(xié)調(diào)的E2/P比造成了LPAR3表達(dá)的異常。我們可能通過(guò)調(diào)節(jié)E

16、2/P比值，使LPAR3的表達(dá)恢復(fù)正常狀態(tài)，提高IVF妊娠率。
　　 第三部分 LPAR3在PCOS患者月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜上的表達(dá)
　　 目的:研究溶血磷脂酸受體3(Lysophosphatidic acid receptor3，LPAR3)mRNA及其蛋白在PCOS月經(jīng)稀發(fā)患者月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜上的表達(dá)。
　　 方法:采用RT-PCR，Western blot方法，檢測(cè)LPAR3 mRNA和蛋白在PCOS月經(jīng)稀發(fā)

17、患者月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜上的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.PCOS組患者月經(jīng)周期天數(shù)為39.75天，明顯多于NC對(duì)照組月經(jīng)周期天數(shù)30.5天(P＜0.01)。在增殖期PCOS組血清中LH水平為8.61miu/ml，高于NC組增殖期血清中LH水平3.10miu/ml，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。在早、中分泌期PCOS組患者血清中P水平1.64ng/ml、6.36ng/ml，明顯低于NC組P水平4.46ng/ml、14.2

18、ng/ml，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 2.PCOS組在整個(gè)增生期LPAR3 mRNA和蛋白在子宮內(nèi)膜上呈低表達(dá)狀態(tài)，但與NC對(duì)照組增生期相比要高于NC對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在早分泌期LPA3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，并且達(dá)到峰值，在中分泌期LPAR3 mRNA和蛋白的表達(dá)驟然下降，恢復(fù)到增生期水平。PCOS組中LPAR3mRNA和蛋白水平在早分泌期子宮內(nèi)膜上的表達(dá)要明顯低于NC對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)下圖）。

19、r>　　 結(jié)論:
　　 1.PCOS組中增生期LPAR3的異常表達(dá)可能和PCOS患者子宮內(nèi)膜過(guò)度增殖相關(guān)。
　　 2.PCOS組中在早分泌期即圍著床期LPAR3的表達(dá)較NC對(duì)照組低，這可能干擾了其子宮內(nèi)膜容受性的建立，降低了子宮內(nèi)膜的容受性。
　　 3.PCOS組在增生期血清中LH水平的高表達(dá)以及在分泌期P的低表達(dá)狀態(tài)可能和其子宮內(nèi)膜上LPAR3異常表達(dá)相關(guān)。
　　 第四部分兩種雌孕激素替代法內(nèi)膜準(zhǔn)備對(duì)

20、多囊卵巢綜合癥冷凍胚胎移植臨床效果的比較
　　 目的:比較非降調(diào)節(jié)雌孕激素替代法與降調(diào)節(jié)雌孕激素替代法作為子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方法對(duì)多囊卵巢綜合癥患者(PCOS)凍融胚胎移植(FET)的妊娠結(jié)局。
　　 方法:在PCOS患者FET周期中，分別采用非降調(diào)節(jié)雌孕激素替代法（GnRHa組，n=89）、降調(diào)節(jié)雌孕激素替代法（HRT組，n=37）準(zhǔn)備內(nèi)膜，比較周期妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、宮外孕發(fā)生率等指標(biāo)。
　　 結(jié)果:
　

21、　 1.HRT組和GnRHa組2組患者年齡分別為29.53±3.39歲、29.24±2.85歲(P＞0.05);基礎(chǔ)體重指數(shù)分別為23.07±3.51、22.20±2.96(P＞0.05);不孕年限分別為3.14±1.89年、3.86±1.36年(P＞0.05);
　　 2.在黃體支持日HRT組和GnRHa組2組患者E水平分別為189.72±110.88pg/ml、133.08±55.33pg/ml(P＜0.05); LH水平

22、分別為11.74±6.49miu/ml、1.3±0.67miu/ml(P＜0.01)。
　　 3.2組移植周期臨床妊娠率為55.06％、72.9％(P＜0.05);種植率分別為38.7％、53.6％(P＜0.05);流產(chǎn)率分別為16.3％、14.8％(P＞0.05);宮外孕率分別為4.1％、3.7％(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:對(duì)于PCOS患者使用降調(diào)節(jié)雌孕激素替代法可能改善子宮內(nèi)膜的容受性，是一種合適的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方