GnRHa對SD大鼠子宮內膜容受性的影響.pdf

1、目的：
　　體外受精-胚胎移植（invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET）中，優(yōu)質的胚胎、接受態(tài)子宮內膜和胚胎與內膜發(fā)育的同步發(fā)育是胚胎成功種植的關鍵。凍融胚胎移植周期中，在胚胎質量一定的情況下，改善子宮內膜容受性，能改善胚胎種植結局。目前常用的子宮內膜準備方案主要有自然周期、誘導排卵周期及激素替代周期。
　　近年來的研究提示，促性腺激素釋放激素（gonadotrophinrele

2、asinghormone,GnRH）不僅合成于中樞神經系統(tǒng)，通過下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamus-pituitary-ovaryaxis,HPO）作用于卵巢及子宮，在卵巢、子宮等外周生殖系統(tǒng)也有合成，促性腺激素釋放激素受體（gonadotrophinreleasinghormone,GnRHR）在卵巢顆粒細胞及子宮上皮和基質細胞表達也很豐富，其在子宮內膜的表達在黃體期升高，GnRH可能從多個層面調節(jié)生殖活動，改善子宮內膜容

3、受性。
　　子宮內膜腺體在胚胎種植過程中發(fā)揮著重要作用，白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)是目前公認的子宮內膜容受性的標志物之一，胞飲突被認為是子宮內膜容受性經典的形態(tài)學標志，它們的出現(xiàn)與子宮內膜的“種植窗期”相吻合，子宮內膜腺體在胚胎種植過程中發(fā)揮著重要作用。
　　本研究利用雌（E）、孕激素（P）及促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）建立SD大鼠（Spparague-Dawleyr

4、ats）子宮內膜準備方案模型。分析各方案中大鼠子宮內膜腺體數(shù)目、腺體總面積、LIF表達水平及胞飲突的表達，研究GnRHa對SD大鼠子宮內膜容受性的影響。
　　方法：
　　1、SD大鼠一般狀況評估
　　自入組開始，密切觀察大鼠活動情況，有無活動增多、躁動、進食量減少等低雌激素癥狀。每4天稱量大鼠體重，分析大鼠體重變化，計算大鼠進食量。
　　2、不同方案內膜準備方法SD大鼠模型的建立
　　實驗動物為雌性未孕SD

5、大鼠，每日上午9:00行陰道細胞涂片檢查確定大鼠生殖周期,超聲檢測大鼠子宮內膜厚度，連續(xù)觀察2周期。選60只有正常生殖周期的大鼠，隨機分為四組，自然周期組（naturecyclegroup,NCgroup）、人工周期組(hormonereplacementtherapygroup,HRTgroup)、高劑量GnRHa降調節(jié)聯(lián)合人工周期組（high-doseGnRHaandhormonereplacementtherapygroup,HD

6、G-HRTgroup)、低劑量GnRHa降調節(jié)聯(lián)合人工周期組(low-doseGnRHaandhormonereplacementtherapygroup,LDG-HRTgroup)，每組15只，各組大鼠周齡及體重無差別。
　　自然周期組大鼠肌肉注射無菌注射用水0.2mL，28天后查陰道細胞涂片，動情期與雄鼠合籠，次晨檢出現(xiàn)陰道栓或者記為孕0天；人工周期組大鼠肌肉注射無菌注射用水0.2mL，28天后每日給予補佳樂0.42mg/kg

7、灌胃，超聲監(jiān)測大鼠子宮內膜厚度，達到自然周期中動情期大鼠子宮內膜厚度的平均值2.82mm、陰道細胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細胞時與成年雄鼠合籠，次晨檢測到陰道栓者記為孕0天，同時加用黃體酮6mg/kg肌注；高劑量降調節(jié)聯(lián)合人工周期組、低劑量降調節(jié)聯(lián)合人工周期組于動情間期給予達菲林0.4mg/kg、0.2mg/kg肌肉注射，給藥28天開始給予補佳樂0.42mg/kg灌胃，超聲監(jiān)測子宮內膜厚度，根據(jù)內膜厚度及陰道細胞學涂片

8、情況調節(jié)補佳樂用藥時間，內膜厚度達到自然周期中動情期大鼠子宮內膜厚度的平均值2.82mm、陰道細胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細胞時加用黃體酮6mg/kg肌注，并與雄鼠交配，晨起檢出陰道栓者記孕0天，各組大鼠均于孕4天處死大鼠并取子宮。
　　3、不同內膜準備方案SD大鼠子宮內膜厚度的超聲測量
　　運用PhilipsIU22多普勒超聲儀檢測大鼠子宮內膜厚度，使用30MHZ高頻電子線陣探頭進行檢測，測量雙側子宮內膜

9、最厚的位置的厚度，并取平均值。超聲檢查大鼠子宮內膜厚度的時機為：分組前確定大鼠生殖周期時同時測量生殖各周期大鼠子宮內膜厚度；NC組大鼠檢測動情間期、動情期子宮內膜厚度；HRT組自動情間期開始給補佳樂時監(jiān)測子宮內膜厚度，直至達到自然周期動情期水平2.82mm、陰道細胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細胞時給予黃體酮，HDG-HRT組、LDG-HRT組降調節(jié)0、7、14、21、28天測量大鼠子宮內膜厚度，給補佳樂后每日監(jiān)測子宮內膜

10、厚度，直至達到自然周期動情期水平2.82mm、陰道細胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細胞時給予黃體酮轉化內膜。
　　4、SD大鼠子宮內膜容受性指標的分析方法
　　首先，取各內膜準備方案組中SD大鼠子宮，進行HE染色，從低倍至高倍鏡觀察各組大鼠子宮內膜在光鏡下的組織學形態(tài)，計數(shù)各組大鼠子宮橫斷面中腺體的數(shù)目。HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)（武漢千屏影像技術有限責任公司）分析各個標本橫斷面腺體的總面

11、積。
　　其次，用免疫組化SP法定位大鼠子宮內膜LIF定位并進行半定量分析，每份標本隨機選取5個視野，記錄腔上皮及腺上皮細胞染色強度及各強度細胞數(shù)所占百分比，并用免疫組織化學評分法H-score法對LIF表達量進行半定量分析，計算公式，Pi為陽性細胞百分率，i為染色強度，以每張切片染色底背景作為對照，不顯色或顯色不清為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；深褐色為3分。
　　第三，用S-3500N掃描電鏡觀察大鼠子宮胞飲突表達情

12、況并用胞飲突評分法分析大鼠子宮內膜胞飲突表達量的差異，具體為：掃描電鏡下，放大3500倍，視野下可觀察到的子宮內膜上皮細胞數(shù)量為250個，每個標本隨機選取50個視野，50個視野內胞飲突的表達數(shù)量作為胞飲突評分，計算各組大鼠胞飲突評分均值；
　　5、統(tǒng)計學方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標準差表示，方差齊性檢驗，三組以上采用方差分析，組間差異采用LSD法，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，以α﹦0.05為檢驗水

13、準，當P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學意義；當P＞0.05時，差異無統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、各組SD大鼠一般狀況評估
　　降調節(jié)第5天開始，HDG-HRT及LDG-HRT組大鼠出現(xiàn)躁動，進食量減少等低雌激素癥狀，毛色晦暗；降調第14天，HDG-HRT及LDG-HRT組與自然周期組相比，進食量減少，但無顯著區(qū)別（P=0.100,P=0.120），體重略下降，無統(tǒng)計學差異（P=0.140,P=0.130）。給予雌激素

14、后，降調節(jié)組大鼠進食量增加，體重逐漸上升，低雌激素癥狀消失。處死前，各組大鼠體重無明顯差異（P=0.100），進食量差異無統(tǒng)計學意義（P=0.100）。
　　2、SD大鼠陰道細胞涂片結果
　　自然周期中大鼠陰道細胞涂片呈周期性變化，約4天一周期，依次為動情前期，動情期，動情后期，動情間期。動情前期，持續(xù)約9-18小時，陰道涂片上全部為有核上皮，偶見少量角化細胞；動情期，持續(xù)約1天，陰道涂片顯示全部為無核角化上皮或間有少量上皮

15、細胞；動情后期，持續(xù)約10-14小時，此期陰道涂片顯示為白細胞、角化細胞及有核上皮均有；動情間期，持續(xù)約2-2.5天，此期陰道涂片顯示為大量白細胞及少量上皮細胞和黏液。HRT組大鼠雌激素給藥后，陰道涂片細胞逐漸變化，無核上皮逐漸增多，直至全部為無核上皮。HDG-HRT組、LDG-HRT組大鼠降調節(jié)5天后陰道涂片細胞去周期變化，表現(xiàn)為大量白細胞及少量上皮細胞和黏液，給予雌激素灌胃給藥后逐漸轉變有核上皮至全部變?yōu)闊o核上皮。綜上所述，給予雌激

16、素后，HRT組、HDG-HRT組、LDG-HRT組大鼠陰道細胞涂片逐漸變化，角化上皮逐漸增多直至全部變?yōu)榻腔掀ぃc動情期陰道細胞學涂片表現(xiàn)一致。
　　3、超聲下SD大鼠子宮內膜厚度
　　3.1自然周期SD大鼠生殖周期各期子宮內膜厚度
　　自然周期中大鼠動情周期次序為：動情前期、動情期、動情后期、動情間期，內膜厚度隨動情周期呈周期性變化，分別為2.76±0.08mm,2.82±0.10mm,2.78±0.09mm,2.

17、70±0.07mm。動情期子宮內膜比動情前期、動情后期、動情間期厚（P=0.000,P=0.009,P=0.000）。動情間期子宮內膜最薄，與動情前期相比，無統(tǒng)計學差異（P=0.100）；動情后期子宮內膜厚度大于動情間期（P=0.000）。動情前期與動情后期相比，無顯著差異（P=0.160）。
　　3.2各內膜準備方案中大鼠子宮內膜厚度
　　3.2.1降調節(jié)組SD大鼠子宮內膜變化
　　降調節(jié)第1至28天，HDG-HRT

18、組、LDG-HRT組大鼠子宮內膜逐漸變薄，給藥第7天，兩組大鼠內膜厚度與對照組相比，HDG-HRT組內膜厚度低于LDG-HRT組，差異有統(tǒng)計學意義（1.28±0.05mm,1.53±0.1mm,P=0.000）。降調節(jié)第14天、21天、28天，兩組內膜厚度相比，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.120,P=0.051,P=0.105）。
　　3.2.2各組SD大鼠用藥情況
　　NC組大鼠沒有使用外源性激素，HRT組大鼠沒有使用降調節(jié)

19、藥物。以內膜厚度達到大鼠自然周期動情期子宮內膜平均厚度2.82mm、陰道細胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細胞時為觀察日，各組大鼠雌激素用藥時間進行比較，HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組雌激素用藥天數(shù)分別為4天，10.9天，9.9天，HRT組短于HDG-HRT組和LDG-HRT組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000,P=0.000），HDG-HRT組比LDG-HRT組用藥時間長，但無明顯差別（P=0.068）；HR

20、T組、HDG-HRT組和LDG-HRT組雌激素累計用藥量分別為1.68mg，4.59mg，4.14mg，HRT組顯著低于HDG-HRT組和LDG-HRT組（P=0.000,P=0.000），HDG-HRT組明顯高于LDG-HRT組（P=0.048）。HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組黃體酮使用天數(shù)及劑量相同。
　　3.2.3內膜轉化期各組SD大鼠子宮內膜厚度
　　NC組大鼠動情期子宮內膜厚度為2.81±0.16mm

21、，HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組加用黃體酮日各組子宮內膜厚度依次為2.83±0.2mm，2.83±0.3mm，2.83±0.4mm，各組子宮內膜厚度比較無統(tǒng)計學差異（P=0.110）。
　　4、SD大鼠子宮內膜容受性指標結果
　　4.1光鏡下各組SD大鼠子宮內膜組織形態(tài)比較
　　NC組大鼠腺體數(shù)目為9.7±1.6，腺體面積為1870.07±162.93μm2，HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組腺

22、體數(shù)目分別為9.8±1.5，11.1±1.7，10.8±1.4，腺體面積為1834.87±154.07μm2，2078.76±161.16μm2，2010.88±178.99μm2。HRT組與NC組腺體數(shù)目及面積均無顯著差異（P=0.814,P=0.560）；HDG-HRT組和LDG-HRT組與NC組相比，腺體數(shù)目（P=0.016,P=0.049）及腺體面積（P=0.001,P=0.000）均明顯增大；HDG-HRT組和LDG-HRT組

23、與HRT組相比，腺體數(shù)目增多（P=0.028,P=0.041），腺體面積增大（P=0.000,P=0.000）；HDG-HRT組與LDG-HRT組之間相比，腺體數(shù)目及腺體面積均無統(tǒng)計學差異（P=0.638,P=0.600）
　　綜合以上數(shù)據(jù)及光鏡下觀察子宮內膜形態(tài)，HDG-HRT組、LDG-HRT組與NC組及HRT組相比，腺體數(shù)目更多，形態(tài)不規(guī)則，腺體分泌空泡明顯，腺腔分泌物更多，間質疏松水腫更加明顯。
　　4.2SD大鼠子

24、宮內膜LIF表達情況
　　NC組大鼠種植窗期LIF組織學評分為2.59±0.38，HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組大鼠子宮內膜LIF組織學評分分別為2.58±0.24，2.70±0.42，2.72±0.65，HRT組LIF表達量略低于NC組，但兩組表達量無統(tǒng)計學差異（P=0.657）。HDG-HRT組LIF表達量較LDG-HRT組高，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.460）。HDG-HRT組、LDG-HRT組LIF表達量顯

25、著高于NC組（P=0.000,P=0.000）。HDG-HRT組、LDG-HRT組LIF表達量顯著高于HRT組（P=0.000,P=0.000）
　　4.3SD大鼠子宮內膜胞飲突形態(tài)
　　NC組為發(fā)育完全的胞飲突，表達明顯，發(fā)育同步，大小一致，表面光滑，其余內膜表面被短小的微絨毛覆蓋。HRT組胞飲突為發(fā)育中的胞飲突，發(fā)育不同步，大小不一致，表面不甚光滑，余內膜面可見濃密的微絨毛覆蓋。HDG-HRT組為發(fā)育完全的胞飲突，表達明

26、顯，大小一致，發(fā)育同步，形態(tài)飽滿，表面光滑，微絨毛短小。LDG-HRT組胞飲突表達明顯,發(fā)育同步,大小一致，為發(fā)育完全的胞飲突，形態(tài)飽滿，表面較為光滑，余內膜面微絨毛短小。綜上所述，HRT組與NC組相比，胞飲突大小不一致，表面不夠光滑；經GnRHa預處理的HDG-HRT組、LDG-HRT組與NC組相比，胞飲突發(fā)育完善，形態(tài)更加飽滿，微絨毛短小。
　　4.4SD大鼠子宮內膜胞飲突評分
　　NC組胞飲突評分為674.8±27.2

27、。HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組胞飲突評分分別為666.9±27.5，708.4±30.3，716.7±31.4。各組間相比，HRT組與NC之間相比，胞飲突評分無統(tǒng)計學差異（P=0.459）；HDG-HRT組、LDG-HRT組胞飲突評分顯著高于NC組（P=0.003,P=0.000）；HDG-HRT組、LDG-HRT組胞飲突評分高于HRT組（P=0.000,P=0.000）；HDG-HRT組與LDG-HRT組相比，胞飲突評

28、分無統(tǒng)計學差異（P=0.440）。
　　結論：
　　1、利用促性腺激素釋放激素、雌激素、黃體酮成功建立大鼠子宮內膜人工周期模型、降調節(jié)聯(lián)合人工周期模型。
　　2、HDG-HRT組與LDG-HRT組在光鏡下子宮內膜形態(tài)、電鏡下胞飲突形態(tài)均優(yōu)于NC組及HRT組，子宮內膜腺體數(shù)目及面積、LIF表達量、胞飲突評分高于NC組和HRT組，提示GnRHa能改善子宮內膜容受性。
　　3、在降調節(jié)聯(lián)合人工周期準備方案中，低劑量Gn