GnRHa對SD大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響.pdf

1、目的：
　　體外受精-胚胎移植（invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET）中，優(yōu)質(zhì)的胚胎、接受態(tài)子宮內(nèi)膜和胚胎與內(nèi)膜發(fā)育的同步發(fā)育是胚胎成功種植的關(guān)鍵。凍融胚胎移植周期中，在胚胎質(zhì)量一定的情況下，改善子宮內(nèi)膜容受性，能改善胚胎種植結(jié)局。目前常用的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案主要有自然周期、誘導(dǎo)排卵周期及激素替代周期。
　　近年來的研究提示，促性腺激素釋放激素（gonadotrophinrele

2、asinghormone,GnRH）不僅合成于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamus-pituitary-ovaryaxis,HPO）作用于卵巢及子宮，在卵巢、子宮等外周生殖系統(tǒng)也有合成，促性腺激素釋放激素受體（gonadotrophinreleasinghormone,GnRHR）在卵巢顆粒細(xì)胞及子宮上皮和基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)也很豐富，其在子宮內(nèi)膜的表達(dá)在黃體期升高，GnRH可能從多個層面調(diào)節(jié)生殖活動，改善子宮內(nèi)膜容

3、受性。
　　子宮內(nèi)膜腺體在胚胎種植過程中發(fā)揮著重要作用，白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)是目前公認(rèn)的子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物之一，胞飲突被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜容受性經(jīng)典的形態(tài)學(xué)標(biāo)志，它們的出現(xiàn)與子宮內(nèi)膜的“種植窗期”相吻合，子宮內(nèi)膜腺體在胚胎種植過程中發(fā)揮著重要作用。
　　本研究利用雌（E）、孕激素（P）及促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）建立SD大鼠（Spparague-Dawleyr

4、ats）子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案模型。分析各方案中大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目、腺體總面積、LIF表達(dá)水平及胞飲突的表達(dá)，研究GnRHa對SD大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響。
　　方法：
　　1、SD大鼠一般狀況評估
　　自入組開始，密切觀察大鼠活動情況，有無活動增多、躁動、進(jìn)食量減少等低雌激素癥狀。每4天稱量大鼠體重，分析大鼠體重變化，計(jì)算大鼠進(jìn)食量。
　　2、不同方案內(nèi)膜準(zhǔn)備方法SD大鼠模型的建立
　　實(shí)驗(yàn)動物為雌性未孕SD

5、大鼠，每日上午9:00行陰道細(xì)胞涂片檢查確定大鼠生殖周期,超聲檢測大鼠子宮內(nèi)膜厚度，連續(xù)觀察2周期。選60只有正常生殖周期的大鼠，隨機(jī)分為四組，自然周期組（naturecyclegroup,NCgroup）、人工周期組(hormonereplacementtherapygroup,HRTgroup)、高劑量GnRHa降調(diào)節(jié)聯(lián)合人工周期組（high-doseGnRHaandhormonereplacementtherapygroup,HD

6、G-HRTgroup)、低劑量GnRHa降調(diào)節(jié)聯(lián)合人工周期組(low-doseGnRHaandhormonereplacementtherapygroup,LDG-HRTgroup)，每組15只，各組大鼠周齡及體重?zé)o差別。
　　自然周期組大鼠肌肉注射無菌注射用水0.2mL，28天后查陰道細(xì)胞涂片，動情期與雄鼠合籠，次晨檢出現(xiàn)陰道栓或者記為孕0天；人工周期組大鼠肌肉注射無菌注射用水0.2mL，28天后每日給予補(bǔ)佳樂0.42mg/kg

7、灌胃，超聲監(jiān)測大鼠子宮內(nèi)膜厚度，達(dá)到自然周期中動情期大鼠子宮內(nèi)膜厚度的平均值2.82mm、陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細(xì)胞時(shí)與成年雄鼠合籠，次晨檢測到陰道栓者記為孕0天，同時(shí)加用黃體酮6mg/kg肌注；高劑量降調(diào)節(jié)聯(lián)合人工周期組、低劑量降調(diào)節(jié)聯(lián)合人工周期組于動情間期給予達(dá)菲林0.4mg/kg、0.2mg/kg肌肉注射，給藥28天開始給予補(bǔ)佳樂0.42mg/kg灌胃，超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度，根據(jù)內(nèi)膜厚度及陰道細(xì)胞學(xué)涂片

8、情況調(diào)節(jié)補(bǔ)佳樂用藥時(shí)間，內(nèi)膜厚度達(dá)到自然周期中動情期大鼠子宮內(nèi)膜厚度的平均值2.82mm、陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細(xì)胞時(shí)加用黃體酮6mg/kg肌注，并與雄鼠交配，晨起檢出陰道栓者記孕0天，各組大鼠均于孕4天處死大鼠并取子宮。
　　3、不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案SD大鼠子宮內(nèi)膜厚度的超聲測量
　　運(yùn)用PhilipsIU22多普勒超聲儀檢測大鼠子宮內(nèi)膜厚度，使用30MHZ高頻電子線陣探頭進(jìn)行檢測，測量雙側(cè)子宮內(nèi)膜

9、最厚的位置的厚度，并取平均值。超聲檢查大鼠子宮內(nèi)膜厚度的時(shí)機(jī)為：分組前確定大鼠生殖周期時(shí)同時(shí)測量生殖各周期大鼠子宮內(nèi)膜厚度；NC組大鼠檢測動情間期、動情期子宮內(nèi)膜厚度；HRT組自動情間期開始給補(bǔ)佳樂時(shí)監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度，直至達(dá)到自然周期動情期水平2.82mm、陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細(xì)胞時(shí)給予黃體酮，HDG-HRT組、LDG-HRT組降調(diào)節(jié)0、7、14、21、28天測量大鼠子宮內(nèi)膜厚度，給補(bǔ)佳樂后每日監(jiān)測子宮內(nèi)膜

10、厚度，直至達(dá)到自然周期動情期水平2.82mm、陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細(xì)胞時(shí)給予黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜。
　　4、SD大鼠子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)的分析方法
　　首先，取各內(nèi)膜準(zhǔn)備方案組中SD大鼠子宮，進(jìn)行HE染色，從低倍至高倍鏡觀察各組大鼠子宮內(nèi)膜在光鏡下的組織學(xué)形態(tài)，計(jì)數(shù)各組大鼠子宮橫斷面中腺體的數(shù)目。HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)（武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司）分析各個標(biāo)本橫斷面腺體的總面

11、積。
　　其次，用免疫組化SP法定位大鼠子宮內(nèi)膜LIF定位并進(jìn)行半定量分析，每份標(biāo)本隨機(jī)選取5個視野，記錄腔上皮及腺上皮細(xì)胞染色強(qiáng)度及各強(qiáng)度細(xì)胞數(shù)所占百分比，并用免疫組織化學(xué)評分法H-score法對LIF表達(dá)量進(jìn)行半定量分析，計(jì)算公式，Pi為陽性細(xì)胞百分率，i為染色強(qiáng)度，以每張切片染色底背景作為對照，不顯色或顯色不清為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；深褐色為3分。
　　第三，用S-3500N掃描電鏡觀察大鼠子宮胞飲突表達(dá)情

12、況并用胞飲突評分法分析大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá)量的差異，具體為：掃描電鏡下，放大3500倍，視野下可觀察到的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞數(shù)量為250個，每個標(biāo)本隨機(jī)選取50個視野，50個視野內(nèi)胞飲突的表達(dá)數(shù)量作為胞飲突評分，計(jì)算各組大鼠胞飲突評分均值；
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊性檢驗(yàn)，三組以上采用方差分析，組間差異采用LSD法，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，以α﹦0.05為檢驗(yàn)水

13、準(zhǔn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)P＞0.05時(shí)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、各組SD大鼠一般狀況評估
　　降調(diào)節(jié)第5天開始，HDG-HRT及LDG-HRT組大鼠出現(xiàn)躁動，進(jìn)食量減少等低雌激素癥狀，毛色晦暗；降調(diào)第14天，HDG-HRT及LDG-HRT組與自然周期組相比，進(jìn)食量減少，但無顯著區(qū)別（P=0.100,P=0.120），體重略下降，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.140,P=0.130）。給予雌激素

14、后，降調(diào)節(jié)組大鼠進(jìn)食量增加，體重逐漸上升，低雌激素癥狀消失。處死前，各組大鼠體重?zé)o明顯差異（P=0.100），進(jìn)食量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.100）。
　　2、SD大鼠陰道細(xì)胞涂片結(jié)果
　　自然周期中大鼠陰道細(xì)胞涂片呈周期性變化，約4天一周期，依次為動情前期，動情期，動情后期，動情間期。動情前期，持續(xù)約9-18小時(shí)，陰道涂片上全部為有核上皮，偶見少量角化細(xì)胞；動情期，持續(xù)約1天，陰道涂片顯示全部為無核角化上皮或間有少量上皮

15、細(xì)胞；動情后期，持續(xù)約10-14小時(shí)，此期陰道涂片顯示為白細(xì)胞、角化細(xì)胞及有核上皮均有；動情間期，持續(xù)約2-2.5天，此期陰道涂片顯示為大量白細(xì)胞及少量上皮細(xì)胞和黏液。HRT組大鼠雌激素給藥后，陰道涂片細(xì)胞逐漸變化，無核上皮逐漸增多，直至全部為無核上皮。HDG-HRT組、LDG-HRT組大鼠降調(diào)節(jié)5天后陰道涂片細(xì)胞去周期變化，表現(xiàn)為大量白細(xì)胞及少量上皮細(xì)胞和黏液，給予雌激素灌胃給藥后逐漸轉(zhuǎn)變有核上皮至全部變?yōu)闊o核上皮。綜上所述，給予雌激

16、素后，HRT組、HDG-HRT組、LDG-HRT組大鼠陰道細(xì)胞涂片逐漸變化，角化上皮逐漸增多直至全部變?yōu)榻腔掀ぃc動情期陰道細(xì)胞學(xué)涂片表現(xiàn)一致。
　　3、超聲下SD大鼠子宮內(nèi)膜厚度
　　3.1自然周期SD大鼠生殖周期各期子宮內(nèi)膜厚度
　　自然周期中大鼠動情周期次序?yàn)椋簞忧榍捌?、動情期、動情后期、動情間期，內(nèi)膜厚度隨動情周期呈周期性變化，分別為2.76±0.08mm,2.82±0.10mm,2.78±0.09mm,2.

17、70±0.07mm。動情期子宮內(nèi)膜比動情前期、動情后期、動情間期厚（P=0.000,P=0.009,P=0.000）。動情間期子宮內(nèi)膜最薄，與動情前期相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.100）；動情后期子宮內(nèi)膜厚度大于動情間期（P=0.000）。動情前期與動情后期相比，無顯著差異（P=0.160）。
　　3.2各內(nèi)膜準(zhǔn)備方案中大鼠子宮內(nèi)膜厚度
　　3.2.1降調(diào)節(jié)組SD大鼠子宮內(nèi)膜變化
　　降調(diào)節(jié)第1至28天，HDG-HRT

18、組、LDG-HRT組大鼠子宮內(nèi)膜逐漸變薄，給藥第7天，兩組大鼠內(nèi)膜厚度與對照組相比，HDG-HRT組內(nèi)膜厚度低于LDG-HRT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.28±0.05mm,1.53±0.1mm,P=0.000）。降調(diào)節(jié)第14天、21天、28天，兩組內(nèi)膜厚度相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.120,P=0.051,P=0.105）。
　　3.2.2各組SD大鼠用藥情況
　　NC組大鼠沒有使用外源性激素，HRT組大鼠沒有使用降調(diào)節(jié)

19、藥物。以內(nèi)膜厚度達(dá)到大鼠自然周期動情期子宮內(nèi)膜平均厚度2.82mm、陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細(xì)胞時(shí)為觀察日，各組大鼠雌激素用藥時(shí)間進(jìn)行比較，HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組雌激素用藥天數(shù)分別為4天，10.9天，9.9天，HRT組短于HDG-HRT組和LDG-HRT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000,P=0.000），HDG-HRT組比LDG-HRT組用藥時(shí)間長，但無明顯差別（P=0.068）；HR

20、T組、HDG-HRT組和LDG-HRT組雌激素累計(jì)用藥量分別為1.68mg，4.59mg，4.14mg，HRT組顯著低于HDG-HRT組和LDG-HRT組（P=0.000,P=0.000），HDG-HRT組明顯高于LDG-HRT組（P=0.048）。HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組黃體酮使用天數(shù)及劑量相同。
　　3.2.3內(nèi)膜轉(zhuǎn)化期各組SD大鼠子宮內(nèi)膜厚度
　　NC組大鼠動情期子宮內(nèi)膜厚度為2.81±0.16mm

21、，HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組加用黃體酮日各組子宮內(nèi)膜厚度依次為2.83±0.2mm，2.83±0.3mm，2.83±0.4mm，各組子宮內(nèi)膜厚度比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.110）。
　　4、SD大鼠子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)結(jié)果
　　4.1光鏡下各組SD大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)比較
　　NC組大鼠腺體數(shù)目為9.7±1.6，腺體面積為1870.07±162.93μm2，HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組腺

22、體數(shù)目分別為9.8±1.5，11.1±1.7，10.8±1.4，腺體面積為1834.87±154.07μm2，2078.76±161.16μm2，2010.88±178.99μm2。HRT組與NC組腺體數(shù)目及面積均無顯著差異（P=0.814,P=0.560）；HDG-HRT組和LDG-HRT組與NC組相比，腺體數(shù)目（P=0.016,P=0.049）及腺體面積（P=0.001,P=0.000）均明顯增大；HDG-HRT組和LDG-HRT組

23、與HRT組相比，腺體數(shù)目增多（P=0.028,P=0.041），腺體面積增大（P=0.000,P=0.000）；HDG-HRT組與LDG-HRT組之間相比，腺體數(shù)目及腺體面積均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.638,P=0.600）
　　綜合以上數(shù)據(jù)及光鏡下觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)，HDG-HRT組、LDG-HRT組與NC組及HRT組相比，腺體數(shù)目更多，形態(tài)不規(guī)則，腺體分泌空泡明顯，腺腔分泌物更多，間質(zhì)疏松水腫更加明顯。
　　4.2SD大鼠子

24、宮內(nèi)膜LIF表達(dá)情況
　　NC組大鼠種植窗期LIF組織學(xué)評分為2.59±0.38，HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組大鼠子宮內(nèi)膜LIF組織學(xué)評分分別為2.58±0.24，2.70±0.42，2.72±0.65，HRT組LIF表達(dá)量略低于NC組，但兩組表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.657）。HDG-HRT組LIF表達(dá)量較LDG-HRT組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.460）。HDG-HRT組、LDG-HRT組LIF表達(dá)量顯

25、著高于NC組（P=0.000,P=0.000）。HDG-HRT組、LDG-HRT組LIF表達(dá)量顯著高于HRT組（P=0.000,P=0.000）
　　4.3SD大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突形態(tài)
　　NC組為發(fā)育完全的胞飲突，表達(dá)明顯，發(fā)育同步，大小一致，表面光滑，其余內(nèi)膜表面被短小的微絨毛覆蓋。HRT組胞飲突為發(fā)育中的胞飲突，發(fā)育不同步，大小不一致，表面不甚光滑，余內(nèi)膜面可見濃密的微絨毛覆蓋。HDG-HRT組為發(fā)育完全的胞飲突，表達(dá)明

26、顯，大小一致，發(fā)育同步，形態(tài)飽滿，表面光滑，微絨毛短小。LDG-HRT組胞飲突表達(dá)明顯,發(fā)育同步,大小一致，為發(fā)育完全的胞飲突，形態(tài)飽滿，表面較為光滑，余內(nèi)膜面微絨毛短小。綜上所述，HRT組與NC組相比，胞飲突大小不一致，表面不夠光滑；經(jīng)GnRHa預(yù)處理的HDG-HRT組、LDG-HRT組與NC組相比，胞飲突發(fā)育完善，形態(tài)更加飽滿，微絨毛短小。
　　4.4SD大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突評分
　　NC組胞飲突評分為674.8±27.2

27、。HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組胞飲突評分分別為666.9±27.5，708.4±30.3，716.7±31.4。各組間相比，HRT組與NC之間相比，胞飲突評分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.459）；HDG-HRT組、LDG-HRT組胞飲突評分顯著高于NC組（P=0.003,P=0.000）；HDG-HRT組、LDG-HRT組胞飲突評分高于HRT組（P=0.000,P=0.000）；HDG-HRT組與LDG-HRT組相比，胞飲突評

28、分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.440）。
　　結(jié)論：
　　1、利用促性腺激素釋放激素、雌激素、黃體酮成功建立大鼠子宮內(nèi)膜人工周期模型、降調(diào)節(jié)聯(lián)合人工周期模型。
　　2、HDG-HRT組與LDG-HRT組在光鏡下子宮內(nèi)膜形態(tài)、電鏡下胞飲突形態(tài)均優(yōu)于NC組及HRT組，子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目及面積、LIF表達(dá)量、胞飲突評分高于NC組和HRT組，提示GnRHa能改善子宮內(nèi)膜容受性。
　　3、在降調(diào)節(jié)聯(lián)合人工周期準(zhǔn)備方案中，低劑量Gn