人精原干細(xì)胞分離、鑒定與培養(yǎng)及維甲酸對(duì)其體外誘導(dǎo)分化的作用.pdf

1、背景與目的：
　　男性不育已成為影響男性生殖健康的世界性難題，其中非梗阻性無(wú)精子癥（non-obstructiveazoospermia,NOA）占男性不育癥的10％。然而，目前僅有40%左右的患者可以通過(guò)手術(shù)獲得其精子并結(jié)合輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technique,ART)生育自己子代。精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cell,SSC）作為精子發(fā)生的基礎(chǔ)，可以經(jīng)過(guò)精原細(xì)胞增

2、殖分化、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子形成三個(gè)階段形成精子。大多數(shù)NOA患者都有SSC，若能分離出患者的SSC并將其體外誘導(dǎo)分化為精子（細(xì)胞），則可結(jié)合ART使其生育自己的子代。目前關(guān)于SSC的研究還主要集中在動(dòng)物方面，人SSC（human spermatogonial stem cell,hSSC）的研究還處于起步階段。本研究將CD90（THY-1）作為hSSC的特異標(biāo)志物，聯(lián)合應(yīng)用差異貼壁法和免疫磁珠分選技術(shù)（Magnetic-activa

3、ted cell sorting,MACS）對(duì)生精功能正常的成人SSC進(jìn)行分選，證實(shí)該方法分選hSSC的可行性；同時(shí)對(duì)分選獲得的hSSC進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，初步探討維甲酸（retinoic acid，RA）對(duì)hSSC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的作用，旨在進(jìn)一步完善現(xiàn)有的hSSC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，以期為無(wú)精子癥患者特別是NOA患者體外獲得自身配子提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　第一部分、人精原干細(xì)胞分離、鑒定與培養(yǎng)
　　目的：分離、鑒定和培養(yǎng)h

4、SSC，以獲得純化、富集的hSSC并為其研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：通過(guò)免疫熒光方法檢測(cè)睪丸組織中CD90表達(dá)情況；應(yīng)用兩步酶消化和差異貼壁法分離人睪丸生精細(xì)胞，以CD90為人 SSC標(biāo)志，采用MACS對(duì)人睪丸生精細(xì)胞進(jìn)行分選，并應(yīng)用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)分選所得CD90+細(xì)胞進(jìn)行鑒定；同時(shí)利用SG培養(yǎng)基將CD90+細(xì)胞與支持細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng)。
　　結(jié)果：MACS分選所得CD90+細(xì)胞大小、形態(tài)特征較為均一，

5、RT-PCR檢測(cè)其表達(dá) hSSC標(biāo)記性基因，免疫熒光檢測(cè)其高表達(dá)hSSC特異標(biāo)記GFRA-1、GPR125和UCHL-1，陽(yáng)性率達(dá)90.5%，其在SG培養(yǎng)基中與支持細(xì)胞共培養(yǎng)14d后仍可保持良好活性。
　　結(jié)論：CD90可作為hSSC特異性標(biāo)志之一，結(jié)合差速貼壁和MACS可高效分選hSSC，分選所得SSC可在SG培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)。
　　第二部分維甲酸對(duì)人精原干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的作用
　　目的：探討RA對(duì)hSSC體外

6、誘導(dǎo)培養(yǎng)的作用及其機(jī)制。
　　方法：通過(guò)MACS分選人CD90+SSC，將其與支持細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng)10~15d，并分為未添加RA誘導(dǎo)組和RA誘導(dǎo)組；通過(guò)減數(shù)分裂鋪展實(shí)驗(yàn)和γH2AX免疫熒光染色檢測(cè)RA誘導(dǎo)效率；RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RA誘導(dǎo)前后細(xì)胞基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果：相對(duì)于未添加RA誘導(dǎo)組，RA誘導(dǎo)組中進(jìn)入減數(shù)分裂的細(xì)胞比例明顯增加，當(dāng)RA濃度為8μM時(shí)這一比例達(dá)到最高；RA誘導(dǎo)后可明顯降低精原細(xì)胞基因表達(dá)