棉羊精原干細(xì)胞的分離富集與體外培養(yǎng)研究.pdf

1、精原干細(xì)胞(spermatogonialstemcells，SSCs)是成年雄性動(dòng)物曲細(xì)精管中唯一能進(jìn)行終生自我更新的一類二倍體永生細(xì)胞群。精原干細(xì)胞首先能夠減數(shù)分裂后形成單倍體的生殖細(xì)胞，并且具有類似胚胎干細(xì)胞的發(fā)育多潛能性。對(duì)精原干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾后，能將外源基因穩(wěn)定遺傳到后代基因組中，所以精原干細(xì)胞是進(jìn)行體外操作理想的干細(xì)胞群體。隨著小鼠精原干細(xì)胞培養(yǎng)和移植研究的不斷完善，為各種哺乳動(dòng)物及人類精原干細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立和移植提供了新

2、的思路和技術(shù)路線。大動(dòng)物精原干細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)尚未取得突破性進(jìn)展，目前為止，除了牛精原干細(xì)胞曾培養(yǎng)一個(gè)月的報(bào)道之外，在其他動(dòng)物的精原干細(xì)胞建系和長(zhǎng)期培養(yǎng)成功的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，比較了不同月齡羔羊睪丸曲細(xì)精管中的精原干細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，在此基礎(chǔ)上選擇適齡綿羊，通過(guò)兩步酶消化分離并差異貼壁法富集精原干細(xì)胞，對(duì)精原干細(xì)胞的短期和長(zhǎng)期培養(yǎng)進(jìn)行了初步研究。
　　 一.綿羊精原干細(xì)胞增殖和分化相關(guān)基因的克隆測(cè)序
　　 本

3、研究對(duì)與綿羊睪丸細(xì)胞自我更新、增殖和分化相關(guān)的基因，即PLZF、SCF、c-Kit、PGP9.5、GFRα1、VASA和GATA4以及管家基因GAPDH和18S等進(jìn)行了克隆、測(cè)序。結(jié)果顯示：SCF、c-Kit、18S和GAPDH等4個(gè)基因與已發(fā)表(Pubmed)的綿羊相關(guān)基因序列有同源性；而PLZF、PGP9.5、GFRα1、VASA和GATA4等5個(gè)基因未見(jiàn)有相關(guān)的序列，但與牛的相關(guān)基因有高度同源性。
　　 二.綿羊曲細(xì)精管中

4、精原干細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的觀察
　　 本研究，將1-10個(gè)月齡的羔羊劃分為四個(gè)發(fā)育期，即一期(1-2個(gè)月齡)、二期(3-4個(gè)月齡)、三期(5-6個(gè)月齡)和四期(9-10個(gè)月齡)，以PLZF、PGP9.5、VASA和Vimentin分別作為精原干細(xì)胞(或性原細(xì)胞)、A型精原細(xì)胞、生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞的標(biāo)志基因，觀察曲細(xì)精管中精原干細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。
　　 1.不同月齡羔羊睪丸曲細(xì)精管中PLZF、PGP9.5、VASA和Vimenti

5、n的表達(dá)
　　 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，PLZF在一期的性原細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，到二期在位于靠近基膜的部分精原細(xì)胞的核中表達(dá)，三期和四期，僅在靠基膜的部分精原細(xì)胞中表達(dá)；PGP9.5通常在一期的曲細(xì)精管中心區(qū)的細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá)，之后逐漸從中心區(qū)遷移到基膜附近；VASA在一期的性原細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，到二期在位于靠近基膜的所有精原細(xì)胞和剛剛發(fā)生的精母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中都均有表達(dá)，發(fā)育到三、四期后，在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、長(zhǎng)形精子細(xì)胞和精子中

6、都均有表達(dá)，而且VASA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量急劇上升；Vimentin主要表達(dá)在支持細(xì)胞的核周圍，強(qiáng)度跟著羔羊月齡的增加而增強(qiáng)，在生殖細(xì)胞中不表達(dá)，小部分間質(zhì)細(xì)胞和血管壁上呈微著色。
　　 根據(jù)以上情況對(duì)曲細(xì)精管中的不同類型細(xì)胞做了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果是一期主要由支持細(xì)胞組成(93％)，性原細(xì)胞約占6.4％；到二期支持細(xì)胞下降為64％，精原干細(xì)胞增加至12.2％，同時(shí)觀察到A型精原細(xì)胞，約占19.8％；在三期和四期，生殖細(xì)胞含量明顯高于一二期(P

7、<0.05)，精原干細(xì)胞下降至4.6％和3.1％，同時(shí)支持細(xì)胞的含量也明顯的減少，分別為37.3％和17.9％，(P<0.05)。以上結(jié)果表明，前兩個(gè)發(fā)育期即4個(gè)月齡以下的羔羊睪丸曲細(xì)精管中精原干細(xì)胞含量相對(duì)多一些，便于分離提純。
　　 2.不同月齡羔羊睪丸曲細(xì)精管中PLZF-PGP9.5、VASA-Vimentin、PGP9.5-Vimentin和PIZF-VASA熒光雙染色結(jié)果
　　 PLZF-PGP9.5熒光雙染色

8、顯示：PLZF的陽(yáng)性反應(yīng)主要發(fā)生在性原細(xì)胞和精原細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，同時(shí)這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)對(duì)PGP9.5染色呈陽(yáng)性；在一期，絕大多數(shù)PGP9.5陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)呈PLZF陽(yáng)性，到了二期，部分PGP9.5陽(yáng)性細(xì)胞中PLZF染色呈陰性，三期和四期，PGP9.5-PLZF雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目逐漸減少。VASA-Vimentim雙染色結(jié)果顯示：VASA染色發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而Vimentin染色發(fā)生在核周圍；四個(gè)發(fā)育期的VASA陽(yáng)性細(xì)胞均呈Vimentin陰性

9、，隨著月齡的增長(zhǎng)VASA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量急劇增多，Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目則相對(duì)穩(wěn)定。PGP9.5-Vimentin染色結(jié)果顯示：PGP9.5陽(yáng)性細(xì)胞與Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞不吻合，PGP9.5陽(yáng)性細(xì)胞成圓形或橢圓形，而Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)則不規(guī)則。PLZF-VASA染色結(jié)果顯示：在一期的性原細(xì)胞中PLZF和VASA都呈陽(yáng)性，到二期，部分VASA陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)PLZF呈陰性；三期和四期，VASA陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量急劇上升，而PLZ

10、F-VASA雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目明顯減少。以上結(jié)果與免疫組織化學(xué)處理結(jié)果基本一致，羔羊曲細(xì)精管內(nèi)的生殖細(xì)胞在兩個(gè)月齡之前尚處于性原細(xì)胞階段，之后逐漸分化為A型精原細(xì)胞和其它向終端分化的細(xì)胞，這表明最佳獲得精原干細(xì)胞的時(shí)期是兩個(gè)月齡以前。
　　 三.綿羊精原干細(xì)胞的分離與純化
　　 本研究利用兩步酶消化法從發(fā)育一到二期羔羊睪丸組織中分離細(xì)胞。結(jié)果是，在一期從1克睪丸組織中可分離出19.2±4.3×107細(xì)胞，但到了二期分離的細(xì)

11、胞數(shù)明顯減少，減至8.0±0.6×107細(xì)胞。
　　 分離后的細(xì)胞通過(guò)差異貼壁法進(jìn)行富集，然后對(duì)剛分離后收集的細(xì)胞(未處理組)、經(jīng)過(guò)2個(gè)小時(shí)純化得到的細(xì)胞(2小時(shí)處理組)和18小時(shí)純化處理得到的細(xì)胞(18小時(shí)處理組)分別進(jìn)行PLZF、VASA、Vimentin染色處理和PLZF-PGP9.5、VASA-Vimentin、PGP9.5-Vimentin和PLZF-VASA熒光雙染色，其結(jié)果是：①在一期PLZF陽(yáng)性細(xì)胞的比例在2小時(shí)

12、處理組和18小時(shí)處理組分別為42.9±6.2％和75.1±4.0％，顯著高于未處理組的7.8±1.3％(P<0.05)；在二期，前兩個(gè)處理組分別為18.6±3.0和28.2±3.3％，仍顯著高于未處理組的3.1±0.6％(P<0.05)；涂片染色還顯示，PLZF陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)出較強(qiáng)和較弱兩種細(xì)胞類型，強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞的體積較小，弱陽(yáng)性細(xì)胞的體積大；強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞比例在2小時(shí)后處理組明顯增加，但與18小時(shí)處理組沒(méi)有顯著差異。②VASA陽(yáng)性細(xì)胞的比例在

13、一、二期2小時(shí)處理組和18小時(shí)處理組均顯著高于未處理組(P<0.05)，而Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞的比例則顯著低于未處理組(P<0.05)。③PLZF-PGP9.5雙陽(yáng)性細(xì)胞比例在一期18小時(shí)處理組達(dá)75％以上。以上結(jié)果表明，在一期(2個(gè)月齡以前)睪丸組織中得到的性原細(xì)胞經(jīng)分離、純化后可以用于體外培養(yǎng)研究。
　　 四.綿羊精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)
　　 1.綿羊精原干細(xì)胞的體外短期培養(yǎng)和免疫細(xì)胞化學(xué)、熒光染色檢測(cè)
　　

14、 以Ⅰ型和Ⅱ型兩種睪丸混合細(xì)胞分別作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，用DMEM/F12+10％FBS基礎(chǔ)培養(yǎng)液對(duì)純化后的性原細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。然后利用免疫細(xì)胞化學(xué)、熒光染色技術(shù)鑒定精原干細(xì)胞。結(jié)果顯示，在兩種飼養(yǎng)層上，均可觀察到如下現(xiàn)象：性原細(xì)胞在培養(yǎng)到1-2天開(kāi)始貼壁，3-4天后分裂增殖。先出現(xiàn)2-32細(xì)胞的鏈狀細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，一周左右后形成細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞團(tuán)的分布均勻，大小比較一致，看不到細(xì)胞間隙，細(xì)胞增殖成融合狀，但Ⅰ型飼養(yǎng)層上的細(xì)胞團(tuán)數(shù)目顯著高于Ⅱ

15、型飼養(yǎng)層上的細(xì)胞團(tuán)數(shù)目。在培養(yǎng)10天左右時(shí)，長(zhǎng)出較大的細(xì)胞團(tuán)，形態(tài)為圓形鳥(niǎo)巢狀集落，中間隆起；體積較小時(shí)顏色較透明，增大后逐漸變得黯淡，邊緣的細(xì)胞呈放射狀生長(zhǎng)；Ⅰ型飼養(yǎng)層上的細(xì)胞團(tuán)的活力明顯大于Ⅱ型飼養(yǎng)層上的細(xì)胞團(tuán)。
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，培養(yǎng)十四天后的精原干細(xì)胞團(tuán)和鏈狀細(xì)胞都顯示較強(qiáng)的PLZF陽(yáng)性，而飼養(yǎng)層不著色。通過(guò)機(jī)械法分離精原干細(xì)胞團(tuán)，然后進(jìn)行短暫胰酶消化處理，再做細(xì)胞涂片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)和熒光染色。結(jié)果顯示，在Ⅰ

16、型飼養(yǎng)層的處理組，30％的細(xì)胞出現(xiàn)PLZF陽(yáng)性；但在Ⅱ型飼養(yǎng)層的處理組，陽(yáng)性細(xì)胞不到10％。在兩種處理組中，VASA陽(yáng)性細(xì)胞的比例都在60％左右，說(shuō)明經(jīng)短期培養(yǎng)后部分細(xì)胞可能開(kāi)始分化。是否血清中的不明成分導(dǎo)致精原干細(xì)胞分化，有待進(jìn)一步探索。
　　 PLZF-VASA熒光雙染色結(jié)果顯示，精原干細(xì)胞團(tuán)里包含PLZF和VASA雙陽(yáng)性的細(xì)胞，而在VASA-Vimentin雙染色中，幾乎看不到Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞，絕大多數(shù)為VASA陽(yáng)

17、性細(xì)胞，表明精原干細(xì)胞團(tuán)可能不包含支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。
　　 2.綿羊精原干細(xì)胞的無(wú)飼養(yǎng)層長(zhǎng)期培養(yǎng)和RT-PCR檢測(cè)
　　 通過(guò)降低血清濃度，同時(shí)添加B27和生長(zhǎng)因子GDNF、LIF和βFGF，在鋪有0.2％明膠的35mm培養(yǎng)皿里無(wú)飼養(yǎng)層長(zhǎng)期培養(yǎng)綿羊精原干細(xì)胞。其結(jié)果3天后出現(xiàn)4到8細(xì)胞的鏈狀細(xì)胞，第5天后鏈狀細(xì)胞的數(shù)量急劇上升，出現(xiàn)32個(gè)細(xì)胞的鏈狀細(xì)胞，但絕大多數(shù)細(xì)胞不貼壁增長(zhǎng)。傳代后大部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁，而且干細(xì)胞團(tuán)數(shù)