吉富羅非魚精原干細(xì)胞分離與體外培養(yǎng)的研究.pdf

1、精子的發(fā)生是一個復(fù)雜而精細(xì)的過程，精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSCs）在雄性性腺中受神經(jīng)內(nèi)分泌和環(huán)境因子的協(xié)同作用而有條不紊的進(jìn)行自我更新和分化，以維持機(jī)體正常的生精功能。精子作為向子代傳遞遺傳信息的載體是進(jìn)行遺傳物質(zhì)改良的最好材料，而生殖干細(xì)胞又是形成精子的前提細(xì)胞，可利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)飼料轉(zhuǎn)化率高、抗病力強(qiáng)及具有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物。盡管人們對精子發(fā)生的一般過程和調(diào)節(jié)機(jī)制有所了解，但對多數(shù)動

2、物精子發(fā)生的特點和調(diào)節(jié)機(jī)制仍然認(rèn)識不清楚。因此在體外模擬雄性動物性腺微環(huán)境培養(yǎng)SSCs對揭秘精子的發(fā)生過程和調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義，為體外生產(chǎn)精子并以精子為載體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織和動物提供材料和技術(shù)，不僅可保護(hù)瀕臨滅絕的遺傳資料也可以生產(chǎn)具有商業(yè)價值的新品種或轉(zhuǎn)基因動物。
　　哺乳動物SSCs體外分離、克隆及誘導(dǎo)等的研究取得了較大的進(jìn)展，而魚類SSCs的研究僅限于斑馬魚和青鳉魚等少數(shù)魚類，國內(nèi)羅非魚SSCs體外分離培養(yǎng)的相關(guān)研究鮮

3、有報道，關(guān)于羅非魚SSCs分離、克隆及凍存的方法還需進(jìn)一步優(yōu)化和探討，因此本研究以雄性吉富羅非魚為模型動物，取精巢為試驗材料做如下研究：
　　1.采用不同消化液和不同分離方法獲得SSCs和SCs，探討CO2和Hepes濃度對羅非魚精巢細(xì)胞原代培養(yǎng)時的影響，然后從形態(tài)學(xué)及HE、油紅O及AKP染色等方法對SSCs和SCs做初步的鑒定；2.用差速貼壁法、克隆環(huán)法和機(jī)械法對SSCs和SCs進(jìn)行純化，用不同飼養(yǎng)層培養(yǎng)羅非魚SSCs并選擇出有

4、利于SSCs增殖的飼養(yǎng)層，然后探討分別添加吉富羅非魚精巢提取液、斑馬魚胚胎提取液、EGF或bFGF時，對以SCs為飼養(yǎng)層培養(yǎng)的SSCs增殖的影響，并繪制生長曲線，以建立吉富羅非魚SSCs的擴(kuò)增體系；3.用不同的凍存液和降溫方式凍存吉富羅非魚 SSCs和 SCs，然后用相同的方法解凍并檢測SSCs和SCs的解凍存活率，最后選擇出有利于SSCs和SCs冷凍保存的凍存液和降溫方式。
　　試驗結(jié)果表明：
　　1．用胰蛋白酶消化吉富羅

5、非魚精巢組織后所得的總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)都顯著高于0.1％膠原酶Ⅳ和0.04% EDTA·Na2（P<0.05），而首次貼壁時間比0.1%膠原酶Ⅳ和0.04%EDTA·Na2組明顯縮短（P<0.05）；胰蛋白酶組與組合酶（膠原酶和胰蛋白酶，下同）組相比總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)和首次貼壁時間都無顯著差異（P>0.05），但胰蛋白酶組消化時間比三個組都短，因此用胰蛋白酶可高效、快速的分離到吉富羅非魚精巢細(xì)胞，用L-15+0.1mmol/Lβ-巰基乙

6、醇+2mmol/L谷氨酰胺+1mmol/L非必需氨基酸+1%羅非魚血清+10%FBS培養(yǎng)分離的細(xì)胞，由于組織塊培養(yǎng)后得到的雜細(xì)胞較多，進(jìn)一步純化SSCs和SCs較困難因而不宜采用；添加5% CO2濃度時不利于吉富羅非魚SSCs和SCs的生長，SSCs和SCs培養(yǎng)的前3d宜在pH為7.2-7.4的培養(yǎng)液中生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，較高的pH更有助于SSCs和SCs的增殖。
　　經(jīng)鑒定胰蛋白酶分離所得的細(xì)胞主要為SSCs和SCs，顯微

7、鏡觀察和HE染色發(fā)現(xiàn)SSCs依附在SCs上呈圓形或卵圓形，體積較大，胞質(zhì)透明并以集落形式生長，油紅O染色發(fā)現(xiàn)SSCs胞質(zhì)中幾乎沒有脂滴，AKP染色呈陽性，而SCs呈三角形或多邊形，胞質(zhì)中含有豐富的脂滴，AKP陰性不著色。
　　2．采用機(jī)械法純化后SSCs和SCs的純度分別為85%和88%；當(dāng)有60%-70%SCs貼壁時可對其進(jìn)行傳代，一般3-4d傳一代，SCs共傳了5代；當(dāng)飼養(yǎng)層上有大量SSCs集落時對SSCs進(jìn)行傳代，發(fā)現(xiàn)原代培

8、養(yǎng)至第5-6d時是SSCs傳代培養(yǎng)的最佳時期。由于SSCs增殖緩慢，一般7d傳一代，已傳至第5代，隔3d換一半的培養(yǎng)液，傳代過程中SSCs和SCs均保持原來的形態(tài)。SCs飼養(yǎng)層與小鼠胎兒成纖維細(xì)胞和大鼠胰腺上皮樣細(xì)胞飼養(yǎng)層相比顯著促進(jìn)SSCs增殖（P<0.05），而后兩種飼養(yǎng)層幾乎對SSCs的增殖沒有影響，反而隨著培養(yǎng)時間的延長抑制其生長。
　　以L-15+1%羅非魚血清+10%FBS為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，SCs為飼養(yǎng)層，分別添加不同濃度

9、的羅非魚精巢提取液、斑馬魚胚胎提取液、EGF或bFGF擴(kuò)增吉富羅非魚SSCs，采用CCK-8法測定第1-7d的細(xì)胞的光密度，繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示上述添加物均能促進(jìn)SSCs增殖，其中添加10%斑馬魚胚胎提取液、10ng/mL EGF或10ng/mL bFGF時顯著促進(jìn)SSCs增殖，以10ng/mL EGF和10ng/mL bFGF促增殖效果最為明顯，而10ng/mL bFGF稍微優(yōu)于10ng/mL EGF。
　　3．凍存液為胎