雞小腸隱窩的分離培養(yǎng)及其特性的研究.pdf

1、小腸是動(dòng)物消化和吸收的重要器官，小腸黏膜是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵部位。小腸上皮細(xì)胞向下移動(dòng)凹陷后形成隱窩結(jié)構(gòu)，大約6～10個(gè)隱窩支持一條小腸絨毛的生長與代謝。隱窩是小腸上皮細(xì)胞的生長源頭，在隱窩的內(nèi)部存在小腸干細(xì)胞和潘氏細(xì)胞。隱窩在小腸的更新中起著十分重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用低溫酶消化并結(jié)合離子螫合劑的方法分離和純化兩周齡雞小腸的隱窩，并將分離到的隱窩進(jìn)行培養(yǎng)，然后檢測(cè)隱窩的進(jìn)行形態(tài)變化、標(biāo)記基因表達(dá)和細(xì)胞增殖活性，旨在建立雞小腸隱窩的分離和培

2、養(yǎng)方法，為家禽小腸更新和功能的研究提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)。
　　1，小腸隱窩的分離和培養(yǎng)
　　小腸隱窩是小腸上皮細(xì)胞下陷而形成的特殊壁龕樣的結(jié)構(gòu)，在隱窩中存在特殊的小腸上皮細(xì)胞如潘氏細(xì)胞和小腸干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)以兩周齡的海蘭雞小腸作為材料，通過低溫物理方法，在離子螯合劑中孵育小腸片段以分離隱窩。剛分離得到的大量絨毛碎片以及單個(gè)細(xì)胞在孵育振蕩后顯微鏡下檢查，可觀察到絨毛-隱窩單位，更換新的分離液后繼續(xù)孵育隱窩，可得到大量小腸隱窩。用20

3、0目篩網(wǎng)過濾以及梯度離心的方法純化隱窩，顯微鏡下檢查計(jì)數(shù)，每只雛雞可獲得15000個(gè)左右結(jié)構(gòu)完整的隱窩。將分離的隱窩按200個(gè)左右/50μl液體的密度接種到Matrigel立體培養(yǎng)基中，同時(shí)加入三組不同濃度的添加物，包括表皮生長因子(EGF)、Noggin和R-Spondin，然后觀察隱窩的生長情況，最終確定隱窩培養(yǎng)基的成分為500μg/ml EGF、100μg/ml Noggine和1000μg/ml R-spondin。隱窩在體外可

4、以生長達(dá)到9d，并且保持結(jié)構(gòu)完整，隱窩直徑從80μm增大到200μm以上，增幅達(dá)200％以上。
　　2，培養(yǎng)的雞小腸隱窩特性的研究
　　雞小腸隱窩體外培養(yǎng)會(huì)形成規(guī)則的球體。透射電鏡觀察結(jié)果表明，培養(yǎng)的隱窩結(jié)構(gòu)完整。干細(xì)胞標(biāo)記物Ascl2、Znrf3、Olfm4、Lgr5、HopX的mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)的隱窩可表達(dá)上述所有小腸千細(xì)胞的標(biāo)記基因。中性紅染色結(jié)果顯示，培養(yǎng)的隱窩被染成紅色，說明培養(yǎng)的隱窩具有良好的活性;5

5、-Ethyny1-2'-deoxyuridine摻入實(shí)驗(yàn)表明，隱窩中存在部分陽性細(xì)胞，這些陽性細(xì)胞是增殖的細(xì)胞。添加CHIR99021（Wnt通路中糖原合成激酶GSK3β的阻斷劑）后發(fā)現(xiàn)，隱窩增長速度加快，體積變大，最大直徑達(dá)到300μm。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的隱窩不僅可以在體外維持存活，細(xì)胞具有增殖活性，而且可對(duì)刺激物CHIR99021的處理有應(yīng)答。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了雞小腸隱窩的分離和培養(yǎng)方法，培養(yǎng)的隱窩可形成球形