人磷酸核糖焦磷酸合成酶(hPRS1)致痛風(fēng)病突變體及人黑色素瘤分化相關(guān)抗原5(MDA5)的結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、1、人源磷酸核糖焦磷酸合成酶(hPRS1)致病突變蛋白和hPRS2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究 人源5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶(hPRS，E.C．2.7.6.1)催化5磷酸核糖(R5P)和三磷酸腺苷酸(ATP)反應(yīng)生成腺苷酸(AMP)和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)，是體內(nèi)嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸代謝的重要調(diào)節(jié)酶。人類(lèi)的prs基因編碼三種hPRS蛋白：hPRS1、hPRS2和hPRS3。至今已有7例在原發(fā)性痛風(fēng)病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的h

2、PRS1蛋白點(diǎn)突變，且均發(fā)現(xiàn)突變導(dǎo)致的酶活性上升是痛風(fēng)的發(fā)病原因。hPRS1的晶體結(jié)構(gòu)已被人發(fā)表，但其突變體導(dǎo)致活性升高的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)研究尚空缺。hPRS2與hPRS1一樣在所有組織都有表達(dá)，目前未有研究發(fā)現(xiàn)hPRS2與痛風(fēng)發(fā)病的關(guān)系，它如何影響PRS在胞內(nèi)活性的有待研究。本研究完成了重組hPRS1蛋白，7個(gè)hPRS1點(diǎn)突變蛋白及hPRS2蛋白的表達(dá)和純化。在分子篩過(guò)程中發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在多種聚集狀態(tài)，故通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射和沉降系數(shù)分析等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

3、各蛋白的聚集狀態(tài)及其在添加底物后的聚集態(tài)的變化情況。同時(shí)應(yīng)用圓二色譜分析了hPRS1蛋白和2個(gè)hPRS1點(diǎn)突變蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和底物、抑制劑對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化等。此外酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)hPRS1點(diǎn)突變蛋白比活性略高于母體蛋白，而hPRS2與hPRS1混合后蛋白比酶活性比二者單獨(dú)的都低。在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)分析母體蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，提出了關(guān)于其中兩個(gè)hPRS1突變體蛋白的可能的結(jié)構(gòu)變化以及該種變構(gòu)如何影響蛋白活性的機(jī)理。hPRS1突變體蛋白及

4、hPRS2的晶體生長(zhǎng)仍在進(jìn)行中，部分已得到針晶在優(yōu)化篩選中。 2、人黑色素瘤分化相關(guān)抗原5(MDA5)各功能片段的表達(dá)、純化和初步晶體學(xué)研究 黑色素瘤細(xì)胞分化相關(guān)抗原5(MDA5)是天然免疫系統(tǒng)中近幾年才被發(fā)現(xiàn)的重要模式識(shí)別受體，能夠在細(xì)胞胞漿內(nèi)特異性識(shí)別一些特定RNA病毒的RNA，通過(guò)不依賴(lài)于TLR3的方式誘導(dǎo)Ⅰ型IFNs，從而誘導(dǎo)具有抗病毒作用的1型干擾素的生成。MDA5具有N端2個(gè)激活下游蛋白的CARD(Caspa

5、serecruitmentdomain)結(jié)構(gòu)域，dsRNA結(jié)合的DExD/HboxRNA解旋酶結(jié)構(gòu)域(HelicaseDomain)及C端的自身抑制結(jié)構(gòu)域(Self-repressionDomain)。病毒的雙鏈RNA被Helicase結(jié)構(gòu)域識(shí)別后，蛋白發(fā)生變構(gòu)暴露CARD結(jié)構(gòu)域，通過(guò)激活病毒誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(Virus-inducedsignalingadaptor)傳導(dǎo)信號(hào)。最近MDA5非常受關(guān)注，但其結(jié)構(gòu)學(xué)研究尚不完善。本研究以

6、進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)解析的研究以及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)為目的，開(kāi)展了對(duì)MDA5各功能結(jié)構(gòu)域的蛋白片段的質(zhì)粒構(gòu)建、表達(dá)和純化工作。總共嘗試了10個(gè)重組蛋白片段的E.coli表達(dá)，其中8個(gè)蛋白沒(méi)有表達(dá)，有2個(gè)蛋白表達(dá)為包涵體，其中的一個(gè)片段HelicaseATPBindingDomain通過(guò)變復(fù)性獲得少量蛋白，但穩(wěn)定性較差，后經(jīng)過(guò)序列改造后該片段在上清中有少量表達(dá)，經(jīng)過(guò)純化純度達(dá)到95％以上。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該蛋白因二硫鍵引起的聚集嚴(yán)重，因而穩(wěn)定性較差，對(duì)于它的晶體