人磷酸核糖焦磷酸合成酶(hPRS1)致痛風病突變體及人黑色素瘤分化相關抗原5(MDA5)的結構和功能研究.pdf

1、1、人源磷酸核糖焦磷酸合成酶(hPRS1)致病突變蛋白和hPRS2蛋白的結構和功能研究 人源5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶(hPRS，E.C．2.7.6.1)催化5磷酸核糖(R5P)和三磷酸腺苷酸(ATP)反應生成腺苷酸(AMP)和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)，是體內嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸代謝的重要調節(jié)酶。人類的prs基因編碼三種hPRS蛋白：hPRS1、hPRS2和hPRS3。至今已有7例在原發(fā)性痛風病人體內發(fā)現(xiàn)的h

2、PRS1蛋白點突變，且均發(fā)現(xiàn)突變導致的酶活性上升是痛風的發(fā)病原因。hPRS1的晶體結構已被人發(fā)表，但其突變體導致活性升高的結構基礎研究尚空缺。hPRS2與hPRS1一樣在所有組織都有表達，目前未有研究發(fā)現(xiàn)hPRS2與痛風發(fā)病的關系，它如何影響PRS在胞內活性的有待研究。本研究完成了重組hPRS1蛋白，7個hPRS1點突變蛋白及hPRS2蛋白的表達和純化。在分子篩過程中發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在多種聚集狀態(tài)，故通過動態(tài)光散射和沉降系數(shù)分析等實驗檢測

3、各蛋白的聚集狀態(tài)及其在添加底物后的聚集態(tài)的變化情況。同時應用圓二色譜分析了hPRS1蛋白和2個hPRS1點突變蛋白的二級結構和底物、抑制劑對蛋白二級結構的變化等。此外酶活性測定發(fā)現(xiàn)hPRS1點突變蛋白比活性略高于母體蛋白，而hPRS2與hPRS1混合后蛋白比酶活性比二者單獨的都低。在以上實驗基礎上，通過分析母體蛋白的晶體結構，提出了關于其中兩個hPRS1突變體蛋白的可能的結構變化以及該種變構如何影響蛋白活性的機理。hPRS1突變體蛋白及

4、hPRS2的晶體生長仍在進行中，部分已得到針晶在優(yōu)化篩選中。 2、人黑色素瘤分化相關抗原5(MDA5)各功能片段的表達、純化和初步晶體學研究 黑色素瘤細胞分化相關抗原5(MDA5)是天然免疫系統(tǒng)中近幾年才被發(fā)現(xiàn)的重要模式識別受體，能夠在細胞胞漿內特異性識別一些特定RNA病毒的RNA，通過不依賴于TLR3的方式誘導Ⅰ型IFNs，從而誘導具有抗病毒作用的1型干擾素的生成。MDA5具有N端2個激活下游蛋白的CARD(Caspa

5、serecruitmentdomain)結構域，dsRNA結合的DExD/HboxRNA解旋酶結構域(HelicaseDomain)及C端的自身抑制結構域(Self-repressionDomain)。病毒的雙鏈RNA被Helicase結構域識別后，蛋白發(fā)生變構暴露CARD結構域，通過激活病毒誘導的信號轉導蛋白(Virus-inducedsignalingadaptor)傳導信號。最近MDA5非常受關注，但其結構學研究尚不完善。本研究以

6、進行晶體結構解析的研究以及免疫學實驗為目的，開展了對MDA5各功能結構域的蛋白片段的質粒構建、表達和純化工作。總共嘗試了10個重組蛋白片段的E.coli表達，其中8個蛋白沒有表達，有2個蛋白表達為包涵體，其中的一個片段HelicaseATPBindingDomain通過變復性獲得少量蛋白，但穩(wěn)定性較差，后經過序列改造后該片段在上清中有少量表達，經過純化純度達到95％以上。實驗發(fā)現(xiàn)該蛋白因二硫鍵引起的聚集嚴重，因而穩(wěn)定性較差，對于它的晶體