下調(diào)ZEB1表達(dá)抑制黑色素瘤干細(xì)胞的致瘤性和肺轉(zhuǎn)移研究.pdf

1、惡性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是來源于黑色素細(xì)胞的一種惡性腫瘤。在過去的20多年中，世界范圍內(nèi)惡性黑色素瘤的發(fā)病率呈逐步增高的趨勢。皮膚是惡性黑素色瘤的主要發(fā)病部位，占皮膚惡性腫瘤的死亡率約70％，也可起源于眼、鼻腔等處，其高度侵襲與轉(zhuǎn)移的能力是惡性黑色素瘤患者死亡的主要原因，早期可轉(zhuǎn)移至肺、腦等部位，晚期隨體循環(huán)擴(kuò)散至全身。而上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelialmesenchymal transition

2、，EMT)在其中扮演著重要角色， EMT被認(rèn)為是啟動腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要事件。研究表明，歷經(jīng)EMT的惡性黑色素瘤細(xì)胞能從腫瘤的原發(fā)灶逃離，侵襲到周圍其他組織，經(jīng)過血液或淋巴途徑到達(dá)更遠(yuǎn)處的器官形成轉(zhuǎn)移灶。新近研究還發(fā)現(xiàn)，有EMT表型的惡性黑色素瘤細(xì)胞更具耐藥性、免疫抑制及類干細(xì)胞等特性。在EMT的發(fā)生發(fā)展過程中最主要的調(diào)控對象是E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)。該蛋白是維持上皮細(xì)胞特性的重要分子，E-cadherin的丟失是EMT的

3、一個(gè)重要特征，若E-cadherin表達(dá)下降，細(xì)胞則會呈現(xiàn)許出多非上皮細(xì)胞的特征，如細(xì)胞極性丟失，細(xì)胞間的粘附性降低，轉(zhuǎn)變成更易發(fā)生轉(zhuǎn)移的間質(zhì)細(xì)胞，而表達(dá)波形蛋白（Vimentin）上調(diào)，這些蛋白表達(dá)改變是EMT的一個(gè)重要標(biāo)志。因此，探究EMT的發(fā)生和調(diào)控機(jī)制，對于尋找治療腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)有重要意義。
　　隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中有極少數(shù)細(xì)胞具有類于細(xì)胞的特性:能無限增殖、不斷分化，對化療、放療不敏感，而這些細(xì)

4、胞成為腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞(tumor stem ceils，TSCs)或癌干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)。近來對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的研究表明，鋅指結(jié)合蛋白（1zinc finger E-box-binding protein1，ZEB1）在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。ZEB1是鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子中的E盒結(jié)合鋅指蛋白，它不僅能調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生和發(fā)展，還能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、衰老、

5、侵襲轉(zhuǎn)移和間質(zhì)血管生成等，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:降低B16F10細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)，可在一定程度上降低B16F10細(xì)胞在體外的克隆形成能力、增殖能力、耐藥性、侵襲轉(zhuǎn)移能力及體內(nèi)致瘤能力，但對B16F10細(xì)胞中CSCs的影響如何，期待進(jìn)一步探討。正因如此，本研究選擇小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10細(xì)胞中CD133+ CD44+CSCs作為研究對象，將其從B16F10細(xì)胞中分離，探討下調(diào)ZEB1的表達(dá)對CD44+CD

6、133+CSCs的致瘤性和肺轉(zhuǎn)移的影響，從而為惡性黑色素瘤的治療提供新的思路。
　　目的:
　　探討下調(diào)黑色素瘤CSCs中ZEB1的表達(dá)對其致瘤性和肺轉(zhuǎn)移的影響，為尋找黑色素瘤新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.將構(gòu)建好的靶向鼠ZEB1基因的pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA干擾質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞，并通過G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　2.用免疫磁選技術(shù)從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p

7、SUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA的B16F10克隆中分離獲取ZEB1-shRNA2CD133+CD44+CSCs以及scramble-shRNA CD133+CD44+CSCs;從B16F10細(xì)胞中分選出CD133+CD44+CSCs。
　　3.通過劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲性實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)致瘤性、荷瘤鼠生存實(shí)驗(yàn)及肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，綜合分析下調(diào)ZEB1表達(dá)后對B16F10 CD44+CD133+ CSCs的致瘤性和肺轉(zhuǎn)移的影響。
　　

8、4.用2×104 B16F10 CD44+CD133+CSCs、ZEB1-shRNA CD44+CD133+CSCs、scramble-pSUPER-EGFP CD44+CD133+CSCs分別攻擊C57BL/6小鼠，通WesternBlotting實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)分別檢測瘤組織中EMT相關(guān)蛋白ZEB1，E-cadherinN-cadherin及Vimentin的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.分離出經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p

9、SUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA的B16F10細(xì)胞克隆;
　　2.用免疫磁選技術(shù)成功分離出ZEB1-shRNA CD133+CD44+CSCs、scramble-pSUPER-EGFP CD133+CD44+CSCs以及B16F10 CD133+CD44CSCs;劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲性實(shí)驗(yàn)、小鼠體內(nèi)致瘤性和肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:B16F10 CD44+CD133+CSCs及scramble-pSUPER-EGFP CD44+C

10、D133+CSCs的侵襲性和轉(zhuǎn)移性以及致瘤性均高于ZEB1-shRNA CD44+CD133+CSCs，差異有顯著性意義(P＜0.01)。
　　3.qRT-PCR法、Western Blotting及免疫組化檢測瘤組織中EMT相關(guān)蛋白顯示:ZEB1-shRNA CD44+CD133+CSCs的靶基因ZEB1表達(dá)減低，間質(zhì)型蛋白Vimentin和N-cadherin表達(dá)下降，而上皮型蛋白E-cadherin的表達(dá)升高;肺組織黑色素瘤