堆肥過程中參與C、N代謝部分功能性微生物群落動(dòng)態(tài)的研究.pdf

1、高溫好氧堆肥是禽畜類糞便以及各種秸稈等農(nóng)業(yè)固體廢棄物的資源化處理方式之一，堆肥過程中微生物利用糞便作為氮源進(jìn)行氮(N)素代謝，利用秸稈等木質(zhì)纖維素類物質(zhì)作為碳源參與碳(C)素代謝。本實(shí)驗(yàn)分A、B兩組設(shè)計(jì)牛糞與稻草秸稈的堆垛式高溫好氧堆肥，兩組處理堆肥初始條件均相同，A組進(jìn)行自然堆肥，B組添加外源菌劑DN-1進(jìn)行菌劑堆肥。采用PCR-DGGE技術(shù)以部分功能基因（碳代謝循環(huán):β-葡萄糖苷水解酶基因的配糖水解酶1家族GH1、配糖水解酶3細(xì)菌家

2、族GH3B、配糖水解酶3真菌家族GH3E;氮代謝循環(huán):氨單加氧酶基因amoA、氧化亞氮還原酶基因nosZ）為分子標(biāo)記基因，設(shè)計(jì)參與碳、氮代謝功能性標(biāo)記基因的通用簡(jiǎn)并引物來研究堆肥過程中碳、氮代謝功能性微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。同時(shí)測(cè)定堆肥過程中溫度、全碳、全氮、硝態(tài)氮(NO3--N)、銨態(tài)氮(NH4+-N)、纖維素降解率、羧甲基纖維素酶(CMC)活性以及β-葡萄糖苷水解酶酶活性的變化，來研究堆肥進(jìn)程中菌劑及酶活等理化指標(biāo)與微生物群落結(jié)構(gòu)

3、動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)性。研究結(jié)果如下:
　　1.A組處理0～3d為堆肥的升溫期，3～18d為堆肥的高溫期，最高溫度在堆肥第10d達(dá)到59℃，18～28d為堆肥的降溫期，28d之后進(jìn)入堆肥腐熟期。B組處理0～2d為堆肥的升溫期，2～22d為堆肥的高溫期，最高溫度在堆肥第5d達(dá)到70℃，22～28d為堆肥的降溫期，28d之后為堆肥的腐熟期。A組處理在堆肥第31d全C含量為346.5g/kg，全N含量為18.5g/kg，C/N為19.5，NH

4、4+-N含量為0.28g/kg，NO3--N含量為1.35g/kg，NH4+-N/NO3--N為0.34，纖維素降解率為31.27％。B組處理在堆肥第31d全C含量為360.8g/kg，全N含量為19.4g/kg，C/N為18.5，NH4+-N含量為0.19g/kg，NO3--N含量為1.43g/kg，NH4+-N/NO3--N為0.13，纖維素降解率為62.57％。添加外源菌劑能促進(jìn)堆體溫度升高，提高纖維素的降解速率，促進(jìn)堆肥更快達(dá)到

5、腐熟。
　　2.A、B兩種處理CMC酶活性的峰值分別在堆肥第26d和第12d，為12.44U/L和14.81U/L，在堆肥結(jié)束時(shí)CMC酶活性降到最低，為6.43U/L和6.71U/L。A、B兩組β-葡萄糖苷水解酶酶活性分別在堆肥的第20d和12d達(dá)到最高，為0.64U/L和0.66U/L，在堆肥的第8d兩種處理β-葡萄糖苷水解酶的活性降到最低分別為0.45U/L及0.48U/L。
　　分析β-葡萄糖苷水解酶功能性基因的PCR

6、-DGGE結(jié)果，A組含β-葡萄糖苷水解酶功能性基因的微生物多樣性高于B組。GH3真菌家族微生物多樣性高于GH1家族和GH3細(xì)菌家族。堆肥的升溫期和高溫前期(0～8d) GH1、GH3細(xì)菌家族在降解纖維素過程中發(fā)揮主要作用，優(yōu)勢(shì)菌種是枯草芽孢桿菌屬（Bacillus subtilis）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、纖維弧菌屬（cellvibrio gilvus）。堆肥的中后期，β-葡萄糖苷水解酶活性增強(qiáng)，GH3真菌家族成為主要的

7、功能性群落組成，優(yōu)勢(shì)菌種是木霉屬（Trichoderma）和黑曲霉屬(Aspergillus)。從聚類分析來看，GH1家族B5、B6泳道的相似性達(dá)72％，說明B組堆肥高溫后期和降溫期GH1家族微生物群落結(jié)構(gòu)較為相似。GH3細(xì)菌家族泳道A2、A4的相似率為68％，表明A組堆肥高溫前期GH3細(xì)菌家族微生物群落結(jié)構(gòu)相似性較高。GH3家族菌劑堆肥高溫后期泳帶B5、B6相似性較高為67％，表明B組堆肥降溫期GH3真菌家族微生物群落結(jié)構(gòu)相似性較高。

8、
　　3.在本實(shí)驗(yàn)堆肥過程中，反硝化細(xì)菌微生物的多樣性高于硝化細(xì)菌，A組微生物多樣性高于B組。從聚類分析來看，反硝化細(xì)菌B4、B6泳道的相似達(dá)到71％，表明反硝化細(xì)菌在B組的高溫后期和降溫期群落組成最為相似。大部分堆肥樣品集中在第一主成份的正端，表明A組在堆肥各時(shí)期反硝化細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)較為相似。該堆肥實(shí)驗(yàn)中反硝化細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬為假單孢桿菌屬（Pseudomonas）。硝化細(xì)菌DGGE圖譜A6和B1泳道的相似性達(dá)到70％，表明硝