腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的分子分析.pdf

1、腸道菌群對(duì)宿主的消化、免疫和抗病等功能具有重要的影響。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)不能客觀全面地反映腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)人和動(dòng)物(昆蟲(chóng)和大熊貓)腸道微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。 過(guò)去的研究表明，人的腸道菌群結(jié)構(gòu)具有顯著的個(gè)體差異，但健康的個(gè)體會(huì)共有一些類群，對(duì)人體健康影響可能較大。如何通過(guò)比較不同健康狀況的個(gè)體的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)這些健康個(gè)體所共有的微生物類群是一個(gè)很有意義的研究課題。本研究發(fā)展和建立了一種基于ERI

2、C-PCR(EnterobacterialRepetitiveIntergenicConsensus[ERIC]PCR)指紋圖分析的新方法用于尋找健康腸道共有菌群的分子標(biāo)記。其核心是用ERIC-PCR比較不同腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)特征并結(jié)合DNA雜交鑒定健康個(gè)體樣品中共有的基因組片段。12例不同健康狀況的人和豬糞便樣品的ERIC-PCR指紋圖表明每例個(gè)體具有獨(dú)特而穩(wěn)定的指紋圖。用地高辛把一個(gè)健康兒童樣品的ERIC-PCR混合產(chǎn)物標(biāo)記作為探

3、針，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，對(duì)不同樣品中同樣大小的條帶的DNA片段的序列同源性進(jìn)行了分析。雜交圖譜與原來(lái)的凝膠電泳指紋圖譜的比較分析表明有(500bp、800bp和1000bp)3個(gè)條帶是健康腸道樣品共有的特征條帶。針對(duì)這3個(gè)條帶分別建立克隆文庫(kù)分析其中的DNA序列多樣性，結(jié)果得到17個(gè)基因組片段，其中3個(gè)與Bacteroidesthetaiotaomicron的基因組區(qū)域具有很高的同源性，其余片段是所謂“孤兒序列”，在GenBank中沒(méi)有發(fā)

4、現(xiàn)任何具有顯著同源性的序列。用序列專一性PCR實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了其中豐度最高的7個(gè)片段在健康腸道中出現(xiàn)的概率，結(jié)果表明，有一個(gè)片段出現(xiàn)在所有32個(gè)健康人和13只健康仔豬的腸道里，但在腹瀉兒童腸道里很少出現(xiàn)；有2個(gè)片段在健康人組和發(fā)生非感染性腹瀉的兒童組腸道里出現(xiàn)，但在發(fā)生感染性腹瀉的兒童腸道里基本檢測(cè)不到。用本研究發(fā)展的這種新的技術(shù)方法可以克隆到健康腸道共有的微生物類群的基因組片段，作為相應(yīng)細(xì)菌的分子標(biāo)記，可以設(shè)計(jì)專一性的引物和探針，既可用于研

5、究相應(yīng)的細(xì)菌在腸道中的動(dòng)力學(xué)變化與宿主健康的關(guān)系，也可用于其在序列引導(dǎo)下的分離。我們的研究還表明，本方法并不局限于使用ERIC引物，依據(jù)長(zhǎng)引物隨機(jī)PCR原理設(shè)計(jì)的引物很多都可以用于分析微生物群落結(jié)構(gòu)，而且本方法也不局限于分析比較腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，它在各類不同的微生物群落結(jié)構(gòu)分析中都具有應(yīng)用潛力。 宿主遺傳特性對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響是腸道生態(tài)學(xué)中一個(gè)重要的科學(xué)問(wèn)題。我們用16SrDNA克隆文庫(kù)分析和16SrDNAV3區(qū)PCR-TG

6、GE指紋圖分析方法對(duì)棉鈴蟲(chóng)(H.armigera)和煙青蟲(chóng)(H.assulta)這兩種近緣昆蟲(chóng)的腸道菌群進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，食譜廣泛的棉鈴蟲(chóng)比食譜狹窄的煙青蟲(chóng)具有較高的腸道菌群多樣性。棉鈴蟲(chóng)腸道中的優(yōu)勢(shì)菌類型是Ochrobactrumsp.，而煙青蟲(chóng)的是Lactobacillusmali。這兩種供試?yán)ハx(chóng)在同樣的飼養(yǎng)環(huán)境和人工飼料上連續(xù)飼養(yǎng)了10代以上，但卻建立了具有顯著差異的腸道菌群結(jié)構(gòu)。本研究表明宿主遺傳特性在決定腸道菌群結(jié)構(gòu)中具有

7、比環(huán)境條件更重要的作用。 大熊貓是食肉目動(dòng)物，具有與食肉動(dòng)物相似的腸道結(jié)構(gòu)，但卻主要以竹子為食，而且消化率只有20﹪。本研究以飼養(yǎng)在兩個(gè)動(dòng)物園的2只成年和1只幼年大熊貓為對(duì)象，用基于16SrDNA的方法分析了其腸道優(yōu)勢(shì)菌的多樣性。16SrDNAV3區(qū)的PCR-TGGE指紋圖分析表明這些個(gè)體之間的腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性較高，其TGGE圖譜間的相似性系數(shù)超過(guò)60﹪。3只個(gè)體共有1條優(yōu)勢(shì)主帶，經(jīng)測(cè)序分析是大腸桿菌。用1只雄性成年大熊貓的腸