堆肥中β-glucosidase家族微生物群落與纖維素降解的相關(guān)性研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)采用室內(nèi)小型堆肥反應(yīng)器以牛糞與稻草為堆肥物料進(jìn)行為期一個(gè)月的高溫好氧堆肥。對堆體上、中、下層的溫度及環(huán)境溫度進(jìn)行測定;對堆肥物料中纖維素、木質(zhì)素和半纖維素的相對含量進(jìn)行測定;利用高效液相色譜法(HPLC)測定葡萄糖含量和纖維二糖的含量;測定羧甲基纖維素酶（CMC酶）活性和β-葡萄糖苷水解酶(β-glucosidase)活性;通過構(gòu)建β-glucosidase GH1、GH3家族基因克隆文庫的手段分析堆體中具有β-glucosidas

2、e GH1、GH3家族基因功能性微生物的群落組成和優(yōu)勢微生物種屬;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)判定β-glucosidaseGH1、GH3家族中優(yōu)勢微生物種屬在堆肥各個(gè)時(shí)期的基因拷貝數(shù)的變化。通過分析堆肥進(jìn)程中含β-glucosidase基因功能性微生物群落的演替、優(yōu)勢微生物種屬基因拷貝數(shù)的變化規(guī)律與β-glucosidase活性變化規(guī)律的相關(guān)性，進(jìn)一步揭示含β-glucosidase基因功能性微生物的種類與拷貝數(shù)的變化規(guī)律與纖

3、維素類物質(zhì)降解的潛在關(guān)系。研究結(jié)果如下:
　　在堆肥進(jìn)程中，堆體的平均溫度在前3d，快速升溫達(dá)到45℃即進(jìn)入高溫期，并維持8d后進(jìn)入降溫期最后與環(huán)境溫度變化趨于一致。纖維素的相對含量在高溫期階段變化明顯，半纖維素的相對含量變化趨勢與其相似，木質(zhì)素的相對含量總體上變化不大，且在降溫腐熟期有小幅的增加。葡萄糖含量在0-1d呈現(xiàn)下降趨勢，在堆肥的第4d葡萄糖含量出現(xiàn)第一個(gè)峰值(1.85 mmol/kg)，第4-7 d呈現(xiàn)下降趨勢。第23

4、 d葡萄糖的含量達(dá)到第二個(gè)峰值(5.35mmol/kg)。在第0-4 d，纖維二糖的含量的變化趨勢是先升高后降低，在高溫階段的后期和降溫腐熟的前期，纖維二糖含量一直處于較低水平，維持在0 mmol/kg-0.91 mmol/kg范圍內(nèi)，與同一時(shí)期β-葡萄糖苷水解酶的較高活性相對應(yīng)。從堆肥的第13d起，纖維二糖大量累積，在第29 d的達(dá)到最大值(1.29 mmol/kg)。β-glucosidase活性在第4d達(dá)到整個(gè)堆肥過程中的最大值(

5、1.482μmol p-Nitr/g dw min)并在降溫腐熟期維持在0.429μmol p-Nitr/g dw min-0.533μmol p-Nitr/g dw min范圍內(nèi);CMC酶活性變化趨勢與β-glucosidase活性相似并在第7d達(dá)到最大值(47.67μg glucose/g dw min)。
　　在對克隆序列進(jìn)行比對分析的過程中發(fā)現(xiàn)，GH1細(xì)菌家族中，k-卡拉膠降解菌屬（Devosiasp.）主要在升溫期、高溫

6、前期和降溫腐熟期出現(xiàn);大豆根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和微桿菌屬（Microbacterium）在各個(gè)時(shí)期均有出現(xiàn);根瘤菌屬（Rhizobium）在各個(gè)時(shí)期均有出現(xiàn)，且主要存在于高溫前期和高溫后期;棲熱孢菌屬（Thermotoga）等在高溫前期出現(xiàn)的次數(shù)較多。GH3細(xì)菌家族中，寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）在各個(gè)時(shí)期均有出現(xiàn)，多數(shù)存在于升溫期中;新月形單胞菌屬（Pelosinus）在升溫期和高溫前期出現(xiàn)的次

7、數(shù)較多;分支桿菌屬（Mycobacterium）在高溫前期、高溫后期和降溫腐熟期中均有出現(xiàn)。GH3真菌家族中，木霉屬（Hypocrea）在升溫期、高溫前期和降溫腐熟期中均有出現(xiàn)，在降溫腐熟期出現(xiàn)的次數(shù)較多;曲霉屬（Aspergillus）各個(gè)時(shí)期均有出現(xiàn)，在升溫期中出現(xiàn)的次數(shù)較多;青霉屬（Penicillium）主要存在于升溫期和降溫腐熟期。
　　在對q-PCR獲得的β-glucosidase GH1家族通用引物的基因拷貝數(shù)的分析

8、中可以發(fā)現(xiàn)，升溫期和降溫腐熟期的基因拷貝數(shù)較高溫期多。分析8對β-glucosidase GH1家族特異性引物可以發(fā)現(xiàn)，GH1-5-2、GH1-3-9、GH1-3-5這三對引物在q-PCR獲得的高溫期的基因拷貝數(shù)明顯高于升溫期和降溫腐熟期，說明Rhizobium和Thermotoga的基因拷貝數(shù)在高溫期與β-glucosidase的產(chǎn)生和纖維素的降解存在正相關(guān)性，即在Rhizobium和Thermotoga對β-glucosidase的

9、產(chǎn)生和纖維素的降解起著主要作用。q-PCR獲得GH3細(xì)菌家族的4對特異性引物的基因拷貝數(shù)在升溫期都較高，在高溫期基因拷貝數(shù)較低。證明Stenotrophomonas、Pelosinus和Mycobacterium均在升溫期產(chǎn)生β-glucosidase對纖維素的降解起到一定作用，而在高溫期的作用較弱。GH3B-3這對引物在降溫腐熟期的基因拷貝數(shù)明顯高于其他三個(gè)時(shí)期，可以說明Mycobacterium在降溫腐熟期產(chǎn)生β-glucosida

10、se和纖維素的降解過程中起到主要作用。q-PCR獲得的β-glucosidase GH3真菌家族通用引物的基因拷貝數(shù)在各個(gè)時(shí)期都處于較高水平，這與真菌是纖維素降解的主要微生物群體有關(guān)。同時(shí)，分析3對特異性引物獲得的基因拷貝數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，3對引物在q-PCR獲得的基因拷貝數(shù)在各個(gè)時(shí)期的趨勢相同，并可以看出Hypocrea、Aspergillus和Penicillium在升溫期和降溫腐熟期對β-glucosidase的產(chǎn)生和纖維素的降解起到主