黃瓜耐低氮脅迫生理及分子機(jī)制初步研究.pdf

1、黃瓜（Cucumis sativus L.）是設(shè)施栽培中重要的園藝作物之一，也是一種典型的喜硝肥作物。農(nóng)戶為了提高黃瓜產(chǎn)量往往盲目施用氮肥，在一定程度上造成了環(huán)境污染及果實(shí)硝酸鹽含量超標(biāo)等問(wèn)題。科學(xué)施用氮肥的同時(shí)培育耐低氮黃瓜品種是解決上述問(wèn)題的有效途徑。探究黃瓜耐低氮分子機(jī)制，挖掘耐低氮相關(guān)基因能夠?yàn)闊o(wú)公害蔬菜育種提供理論參考。
　　為了增加人們對(duì)黃瓜耐低氮機(jī)制的理解，本研究以前期篩選獲得的耐低氮性強(qiáng)的黃瓜品種D0328和耐低氮

2、性弱的黃瓜品種D0422為試驗(yàn)材料。利用同位素示蹤等方法，從生理和分子生物學(xué)角度對(duì)兩個(gè)耐低氮能力不同的黃瓜品種的低氮響應(yīng)模式進(jìn)行比較。以表達(dá)譜結(jié)果為線索，結(jié)合代謝組分析和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，探究黃瓜耐低氮機(jī)制，同時(shí)對(duì)耐低氮相關(guān)基因進(jìn)行功能分析，初步闡述黃瓜耐低氮生理與分子機(jī)制。此外，為了能夠快速準(zhǔn)確地判斷黃瓜生產(chǎn)中的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況，便于及時(shí)施肥控肥，本研究以表達(dá)譜結(jié)果為依據(jù)，利用實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）技術(shù)，篩選黃瓜低氮脅迫marker基

3、因。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)對(duì)耐低氮性強(qiáng)的黃瓜品種D0328和耐低氮性弱的黃瓜品種D0422分別進(jìn)行低氮和正常氮處理，在其生長(zhǎng)發(fā)育的三個(gè)關(guān)鍵時(shí)期（苗期、抽蔓期、盛果期）進(jìn)行氮素吸收、同化和再循環(huán)相關(guān)生理指標(biāo)的檢測(cè)和相關(guān)基因的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種在低氮脅迫時(shí)的氮素吸收和同化能力相近，而D0328的氮素再循環(huán)能力要強(qiáng)于D0422;同位索示蹤結(jié)果進(jìn)一步證明，盛果期D0328氮素再循環(huán)效率高于處于同一時(shí)期的D0422。上述結(jié)果暗示

4、氮素再循環(huán)效率可能是影響黃瓜耐低氮能力的關(guān)鍵因子之一，而氮素吸收和代謝則對(duì)黃瓜耐低氮性影響較小。
　　(2)以低氮和正常氮處理的D0328和D0422兩個(gè)黃瓜品種盛果期源葉為材料進(jìn)行黃瓜耐低氮相關(guān)基因的表達(dá)譜分析，結(jié)果分別在D0328和D0422中鑒定出767（461個(gè)上調(diào)/306個(gè)下調(diào)）和533個(gè)(304個(gè)上調(diào)/229個(gè)下調(diào))差異表達(dá)基因，其中D0328和D0422在低氮脅迫下的特異表達(dá)基因分別為499（293個(gè)上調(diào)/206個(gè)下

5、調(diào)）和265個(gè)（136個(gè)上調(diào)/129個(gè)下調(diào)），共有差異表達(dá)基因268個(gè)。GO分析結(jié)果顯示，D0328中低氮誘導(dǎo)的特異表達(dá)基因主要涉及代謝、有機(jī)化合物生物合成、羧酸合成、有機(jī)酸生物合成和α-氨基酸生物合成等生物進(jìn)程，此外，細(xì)胞氨基酸生物合成、α-氨基酸代謝、谷氨酰胺代謝及生物合成、天冬氨酸生物合成和天門冬氨酸代謝過(guò)程等也參與響應(yīng)黃瓜低氮脅迫。Pathway分析表明，D0328中低氮誘導(dǎo)的特異上調(diào)表達(dá)基因主要涉及氨基酸合成、碳代謝以及光合生

6、物的碳固定等代謝通路。氨基酸含量測(cè)定結(jié)果表明，D0328與D0422盛果期的源葉中生長(zhǎng)素合成重要前體物質(zhì)色氨酸(Trp)含量的變化模式不同，與正常氮條件相比，低氮脅迫時(shí)D0328中Trp含量顯著升高，而D0422中Trp含量卻明顯下降。此外，D0328源葉中生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因CsGH3.17受低氮誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而在D0422中則不受低氮誘導(dǎo)差異表達(dá)。對(duì)兩個(gè)品種盛果期源葉中生長(zhǎng)素含量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，D0328中生長(zhǎng)素含量在低氮脅迫下顯著增加

7、，并且高于D0422。進(jìn)一步研究表明，生長(zhǎng)素類似物萘乙酸(NAA)處理可以增強(qiáng)黃瓜源葉的氮素再循環(huán)能力，相反，抗生長(zhǎng)素2-（對(duì)-氯苯氧）-異丁酸(PCIB)處理則會(huì)抑制黃瓜源葉的氮素再循環(huán)能力。本研究結(jié)果表明生長(zhǎng)素合成可能正向調(diào)控低氮脅迫下黃瓜盛果期源葉的氮素再循環(huán)能力，并且這一正向調(diào)控機(jī)制可能與黃瓜植株具有較強(qiáng)耐低氮能力相關(guān)。
　　(3)黃瓜耐低氮脅迫相關(guān)基因表達(dá)譜中共鑒定出8個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因，其中5個(gè)基因在D0328中

8、特異表達(dá)（4個(gè)上調(diào)/1個(gè)下調(diào)），1個(gè)基因在D0422中特異下調(diào)表達(dá)，其余2個(gè)基因在D0328和D0422中均上調(diào)表達(dá)。這8個(gè)基因編碼的氨基酸數(shù)量在238-432之間，均含有NAC家族蛋白具有的NAM結(jié)構(gòu)域和一段保守結(jié)構(gòu)域WKATGXD(K/R)，且蛋白結(jié)構(gòu)中含有的5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域具有較高相似性。結(jié)合已有報(bào)道，選擇CsNAC036(Csa6M127320.1)進(jìn)行后續(xù)的基因功能分析。利用PCR技術(shù)，獲得全長(zhǎng)為912 bp的CsNAC036基因

9、CDS完整序列后，利用CsNAC036過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)該基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在正常氮素條件下，野生型根長(zhǎng)為5.96±0.1605 cm，低氮處理使得野生型根長(zhǎng)顯著減少了0.11倍，為5.29±0.0951 cm;與正常氮素條件相比，低氮處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)基因植株根長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生變化。此外，無(wú)論是在正常氮還是低氮條件下，轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)均大于野生型，分別為野生型根長(zhǎng)的1.17倍、1.15倍、1.08倍和1.19倍、1.21倍、1.17

10、倍。上述結(jié)果表明CsNAC036過(guò)量表達(dá)能夠提高擬南芥的耐低氮能力。
　　(4)通過(guò)表達(dá)譜分析，利用qRT-PCR等技術(shù)鑒定出黃瓜查爾酮合酶基因(CsCHS)是一個(gè)黃瓜低氮脅迫marker基因。CsCHS首先從黃瓜低氮脅迫相關(guān)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)中被篩選出來(lái)，該基因在D0328和D0422中受低氮誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量一致。qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步表明，CsCHS在不同生態(tài)類型的6個(gè)黃瓜品種及不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)量均受低氮誘導(dǎo)上調(diào)表

11、達(dá)，且表達(dá)量穩(wěn)定，暗示利用CsCHS可以鑒定黃瓜植株是否存在氮素養(yǎng)分不足情況。為了完善這一檢測(cè)體系，我們對(duì)不同濃度NO3-處理(1mM、3mM、5mM、7mM和14 mM NO3-)的黃瓜葉片進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果暗示5 mM NO3-為黃瓜低氮脅迫的臨界濃度。啟動(dòng)子序列分析表明，CsCHS基因啟動(dòng)子區(qū)域中除了TATA-boxes和CAAT-boxes等啟動(dòng)子必需元件以外，還具有激素相關(guān)元件ABREs和AuxRR-core、光響應(yīng)元件GATA-