水通道蛋白1在小鼠內(nèi)耳的超微結(jié)構(gòu)定位及功能探討.pdf

1、水通道蛋白(Aquaporin,AQP)的發(fā)現(xiàn)解決了生理學上一個長期存在的關于生物膜水通透性的問題，PeterAgre因此獲得2003年諾貝爾獎。現(xiàn)認為生物膜的水轉(zhuǎn)運同時存在簡單擴散和通道介導兩種機制，水通道蛋白是介導水分子的順跨膜滲透壓梯度快速轉(zhuǎn)運的膜蛋白家族，在多種類型細胞的質(zhì)膜上表達，現(xiàn)已從哺乳動物克隆了至少11種蛋白亞型(AQP0-10)。 內(nèi)、外淋巴液間的水轉(zhuǎn)運對于調(diào)節(jié)內(nèi)耳液體的容量和維持離子濃度具有重要意義。內(nèi)淋巴液

2、離子組成的變化，特別是體積的增加(內(nèi)淋巴水腫)，將引起內(nèi)耳感覺功能的障礙，如梅尼埃病。目前為止在哺乳動物內(nèi)耳已發(fā)現(xiàn)7種水通道蛋白亞型，其中AQP1在內(nèi)耳分布最為廣泛、表達量也較大。雖然在水通道各亞型中關于AQP1的基礎、臨床研究最為深入，但AQP1在內(nèi)耳的精確定位及其功能仍不清楚，所以本研究首先選擇研究AQP1的免疫組織化學定位、Westernblot半定量分析及超微細胞化學定位，并進一步分析AQP1在內(nèi)耳的功能。 本研究首先應

3、用冰凍切片免疫熒光染色法和兩步法免疫組化(DAB染色)研究AQP1在小鼠內(nèi)耳的組織分布情況，觀察到AQP1表達在小鼠螺旋韌帶緊靠骨壁的Ⅲ型纖維細胞區(qū)域、鼓階和前庭階的間皮細胞及內(nèi)淋巴囊上皮下結(jié)締組織等處。通過Westernblot進一步證實AQP1在小鼠內(nèi)耳耳蝸、前庭和內(nèi)淋巴囊的表達，并半定量的分析出耳蝸內(nèi)AQP1的表達量較在內(nèi)淋巴囊的表達量多。 為進一步分析AQP1在小鼠內(nèi)耳的功能，本研究通過免疫電鏡觀察了AQP1在小鼠內(nèi)耳組

4、織細胞的超微結(jié)構(gòu)定位。在此之前，本研究為兼顧細胞超微結(jié)構(gòu)和抗原活性，通過配比預實驗確定了免疫電鏡實驗時的最佳戊二醛和第一抗體濃度。研究結(jié)果顯示：AQP1同時存在于螺旋韌帶Ⅲ型纖維細胞靠近骨性膠原一側(cè)的細胞膜和靠近腔面一側(cè)的細胞膜上，特別在其豐富的細胞突起上有大量的表達，富含AQP1的細胞突起伸入至疏松的結(jié)締組織中；螺旋緣的纖維細胞及細胞突起的胞膜上也有少量的AQP1表達；AQP1在內(nèi)淋巴囊上皮下結(jié)締組織層的纖維細胞膜上有表達，在細胞突起

5、的胞膜上有大量膠體金顆粒的標記，而細胞體的胞膜上標記相對較少。根據(jù)研究結(jié)果推測AQP1可能在以下方面起作用： 參與鼓階和前庭階之間外淋巴液交換及膜蝸管結(jié)構(gòu)的維持：一般認為鼓階和前庭階之間外淋巴液只在頂回以蝸孔相通，本研究據(jù)以上結(jié)果提出外淋巴液交換可能存在另一途徑——表達AQP1的Ⅲ型纖維細胞可能是鼓階和前庭階之間外淋巴液交換的中介。通過這一外淋巴液交換的新途徑可迅速協(xié)調(diào)鼓階和前庭階之間外淋巴液體滲透壓的變化，使兩階中液體的滲透壓

6、迅速達到平衡，從而維持膜蝸管的正常形態(tài)及其結(jié)構(gòu)功能。 參與耳蝸鉀離子循環(huán)：耳蝸鉀離子循環(huán)可能存在的三個途徑包括外側(cè)循環(huán)途徑、外淋巴途徑和中間途徑。在鉀離子循環(huán)中，螺旋韌帶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型纖維細胞處于外側(cè)循環(huán)途徑和外淋巴途徑的中心位置，其結(jié)構(gòu)和功能的完整對維持耳蝸鉀離子穩(wěn)態(tài)和正常內(nèi)淋巴電位有重要作用。而AQP1表達在與上述細胞相鄰的Ⅲ型纖維細胞膜上，推測其可迅速的彌補由于K+流動引起的滲透壓改變，間接參與鉀離子循環(huán)。螺旋緣的纖維細

7、胞位于中間途徑上，其上表達的少量AQP1可能也起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用。AQP1與其它水通道蛋白亞型之間具有互補或協(xié)同作用，共同維持內(nèi)耳液體的平衡。 與內(nèi)淋巴囊的吸收功能有關：由于內(nèi)淋巴囊近端部上皮細胞間有縫隙，被認為是內(nèi)淋巴囊吸收水的主要部位；而遠端部和中間部上皮細胞間存在大量細胞連接，相對沒有縫隙存在。因此推測水可能經(jīng)內(nèi)淋巴囊近端部上皮細胞間的縫隙進入上皮下網(wǎng)狀結(jié)締組織，并在中間部及遠端部的上皮下結(jié)締組織中相對自由的流動，最終可