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1、該課題采用了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型之一OLETF(OtsukaLong-EvansTokushimaFatty)鼠進(jìn)行六味地黃丸預(yù)防糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究,觀察其對(duì)OLETF鼠糖尿病發(fā)病率的影響,并對(duì)其可能的機(jī)制-β細(xì)胞凋亡和胰島素抵抗的影響進(jìn)行初步探討,為中醫(yī)藥預(yù)防糖尿病提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分六味地黃丸對(duì)OLETF鼠糖尿病發(fā)病的預(yù)防作用 [目的] 通過觀察六味地黃丸對(duì)自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型
2、OLETF鼠糖尿病發(fā)病的影響,探討六味地黃丸對(duì)2型糖尿病的預(yù)防作用,為六味地黃丸預(yù)防2型糖尿病的發(fā)生尋找動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [方法] 1.以自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病對(duì)照鼠LETO(Long-EvansTokushimaOtsuka)鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。大鼠皆為雄性,共分三組。OLETF鼠干預(yù)組(干預(yù)組)和OLETF鼠對(duì)照組(對(duì)照組),每組20只;LETO鼠10只作為正常對(duì)照組(LETO組)。從8周齡開
3、始,干預(yù)組予六味地黃丸溶液灌胃(2.4g·kg-1d-1),其余兩組以等量蒸餾水灌胃。 2.定期行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT),監(jiān)測(cè)血糖。試驗(yàn)前隔夜禁食15小時(shí)、不禁水,按2g/kg予30%葡萄糖溶液灌胃。于空腹及糖負(fù)荷后30、60、90和120min剪尾法取血,以強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀測(cè)定血糖值。血糖峰值>16.7mmol/L和負(fù)荷后120min血糖>11.1mmol/L診為糖尿病,具備上述一條者為糖耐量減低。 3.監(jiān)測(cè)各組
4、大鼠攝食及體重增長(zhǎng)情況,每周稱量大鼠體重和攝食量。于8周齡、32周齡和40周齡分批宰殺大鼠。檢測(cè)血糖、血清甘油三脂、血清膽固醇、血清游離脂肪酸、血漿胰島素。 [結(jié)果] 1.對(duì)照組和干預(yù)組OLETF鼠攝食量一直顯著高于LETO組(p<0.01)。干預(yù)組與對(duì)照組攝食量在各周齡均無顯著差異(p>0.05)。對(duì)照組和干預(yù)組OLETF鼠體重從第6周齡開始顯著高于LETO組(p<0.05),并一直持續(xù)至40周齡實(shí)驗(yàn)結(jié)束,對(duì)照組和干預(yù)
5、組之間各周齡體重均無顯著差異(p>0.05)。 2.對(duì)照組負(fù)荷后2h血糖(2hPG)23周齡明顯升高(10.1±1.8mmol/L),干預(yù)組2hPG30周齡時(shí)出現(xiàn)明顯升高(9.4±2.3mmol/L)。40周齡,干預(yù)組2hPG顯著低于對(duì)照組(p<0.01),葡萄糖曲線下面積(AUC)亦顯著低于對(duì)照組(p<0.05)。干預(yù)組和對(duì)照組在40周齡時(shí)AUC均顯著高于LETO組。 3.對(duì)照組在23周齡始發(fā)生糖尿病,發(fā)病率隨周齡延長(zhǎng)
6、而升高,40周齡發(fā)病率達(dá)92.9%。干預(yù)組30周齡出現(xiàn)第一例糖尿病,40周齡時(shí)發(fā)病率為28.6%,顯著低于對(duì)照組(p<0.01)。LETO組無糖尿病或糖耐量異常(IGT)發(fā)生。 4.干預(yù)組血清甘油三酯、膽固醇、血清游離脂肪酸和血漿胰島素顯著低于對(duì)照組(p<0.05)。 [結(jié)論] 1.六味地黃丸能夠顯著降低OLETF鼠血糖升高程度,延緩高血糖的出現(xiàn)。 2.六味地黃丸可顯著降低OLETF鼠2型糖尿病的發(fā)病率,
7、有效預(yù)防糖尿病的發(fā)生,而且這種預(yù)防作用與大鼠體重的降低無關(guān)。 3.六味地黃丸能夠顯著降低血清甘油三酯、膽固醇、血清游離脂肪酸和血漿胰島素水平。 第二部分六味地黃丸對(duì)OLETF鼠胰島β細(xì)胞凋亡的影響 [目的] 通過觀察六味地黃丸對(duì)OLETF鼠胰島β細(xì)胞凋亡水平及其凋亡相關(guān)因素的影響,對(duì)六味地黃丸抑制胰島β細(xì)胞凋亡的作用和可能機(jī)制進(jìn)行初步探討,為六味地黃丸預(yù)防糖尿病的作用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [
8、方法] 1.分別于8、32和40周齡隨機(jī)處死大鼠。大鼠宰殺后分離胰腺,濾紙吸干水份稱重??v向分離并分別置于4%多聚甲醛、液氮和3%戊二醛中待檢。 2.通過HE染色和免疫組化法觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)改變。相鄰切片分別用HE染色觀察組織學(xué)改變、用免疫組化標(biāo)記胰島β細(xì)胞、TUNEL法標(biāo)記凋亡細(xì)胞。計(jì)數(shù)胰島β細(xì)胞凋亡數(shù)。 3.胰腺石蠟切片免疫組化技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2,觀察其在各組大鼠胰腺中表達(dá)量的變化。 4
9、.液氮內(nèi)存放的胰腺組織提取總RNA,以半定量RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax,觀察其在基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)差別。 5.透射電子顯微鏡觀察胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。 [結(jié)果] 1.各組大鼠胰腺重量隨周齡延長(zhǎng)有逐漸增加的趨勢(shì)。但不同周齡大鼠自身比較及相同周齡各組大鼠間胰腺重量均無顯著性差異(P>0.05)。各組8周齡和32周齡胰腺/體重%無顯著性差異(p>0.05),40周齡LETO組顯著高于干預(yù)組和
10、對(duì)照組(p<0.01)。 2.32周齡,對(duì)照組大鼠胰島纖維化嚴(yán)重,腺泡與胰島散在交錯(cuò);40周齡時(shí),胰島纖維組織增生嚴(yán)重,結(jié)構(gòu)紊亂,出現(xiàn)明顯胰島萎縮。干預(yù)組大鼠多數(shù)胰島仍保留基本形態(tài)。 3.各組大鼠胰島β細(xì)胞凋亡率隨周齡延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì),但無顯著性差異(p>0.05)。對(duì)照組胰島β細(xì)胞凋亡率8周齡時(shí)即高于同周齡LETO組,32周齡始具有顯著性(p<0.01)。干預(yù)組胰島β細(xì)胞凋亡水平32周齡顯著低于對(duì)照組(p<0.01)。
11、 4.干預(yù)組Bcl-2蛋白陽性細(xì)胞率在40周齡顯著高于對(duì)照組(p<0.05),Bcl-2mRNA表達(dá)較對(duì)照組升高(p<0.01),BaxmRNA表達(dá)則較對(duì)照組下降(p<0.01)。5電鏡下可見胰島β細(xì)胞呈典型凋亡改變。干預(yù)組胰島β細(xì)胞可見細(xì)胞器腫脹。 [結(jié)論] 1.六味地黃丸有助于保持OLETF鼠胰島的正常結(jié)構(gòu)。 2.六味地黃丸可顯著降低OLETF鼠胰島β細(xì)胞凋亡水平。 3.六味地黃丸能改變凋亡相關(guān)
12、基因在mRNA和蛋白水平上的表達(dá),使凋亡抑制基因表達(dá)升高,凋亡促進(jìn)基因表達(dá)下降。 第三部分六味地黃丸對(duì)OLETF鼠胰島素抵抗的影響 [目的] 通過六味地黃丸的早期干預(yù),研究其對(duì)OLETF鼠胰島素抵抗的影響;同時(shí)觀察六味地黃丸對(duì)OLETF鼠血漿脂聯(lián)素水平、脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量以及胰島素敏感性相關(guān)指標(biāo)的影響,為該藥預(yù)防和治療糖尿病提供理論依據(jù)。 [方法] 1.分別于8、32和40周齡時(shí)隨機(jī)處
13、死大鼠,采血檢測(cè)空腹血清葡萄糖、游離脂肪酸、甘油三酯、膽固醇、血漿胰島素和脂聯(lián)素水平。 2.取大網(wǎng)膜、附睪脂肪和腎周脂肪組織稱重,計(jì)算內(nèi)臟脂肪重量,并計(jì)算體脂比。 3.采用半定量RT-PCR方法,檢測(cè)脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平。 4.計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。 5.分析血漿脂聯(lián)素水平與各相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。 [結(jié)果] 1.與LETO組相比,對(duì)照組除空腹血糖升高不顯著外,大鼠體重、脂肪
14、含量、體脂比、空腹血漿胰島素、血清甘油三酯、膽固醇均顯著升高,胰島素敏感指數(shù)顯著降低。 2.對(duì)照組血漿脂聯(lián)素水平和脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量與LETO組相比顯著降低。 3.干預(yù)組空腹血糖與對(duì)照組相比無明顯變化,但空腹胰島素和血清甘油三酯、膽固醇均顯著降低,胰島素敏感指數(shù)顯著增高。 4.與對(duì)照組相比,干預(yù)組的血漿脂聯(lián)素水平和脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量均明顯增加。 5.對(duì)照組血漿脂聯(lián)素與胰島素敏感指數(shù)呈正
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