六味地黃丸預(yù)防激素性股骨頭壞死的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:激素性股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是骨科的常見病和疑難病。目前激素性O(shè)NFH的臨床治療進(jìn)展緩慢，往往出現(xiàn)壞死才進(jìn)行治療，嚴(yán)重影響了患者的工作和生活質(zhì)量，由于其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)仍沒有有效的預(yù)防措施，最終大多需行人工全髖關(guān)節(jié)置換。因此，干預(yù)、阻斷使用激素導(dǎo)致的ONFH進(jìn)展，對(duì)其發(fā)病機(jī)制和防治技術(shù)進(jìn)行研究，具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)中，建立激素性股骨頭壞死動(dòng)物模型，應(yīng)用六味地

2、黃丸干預(yù)，探討六味地黃丸預(yù)防ONFH的可行性及分子機(jī)制，為臨床激素必需性應(yīng)用所致ONFH的預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:取成年健康昆明小鼠36只，體重40～50 g，平均46g，隨機(jī)分為3組(n=12)。三組動(dòng)物體重和雌雄數(shù)經(jīng)t檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)?？瞻讓?duì)照組(A組)，馬血清+激素組(B組)，馬血清+激素+六味地黃丸組(C組)；B、C組小鼠按10 mL/kg腹腔注射馬血清，間隔2周后按5 mL/kg再次腹腔注射

3、馬血清，第二次注射馬血清同時(shí)肌肉注射醋酸潑尼松龍45 mL/(kg·d)，共5 d，制備激素性O(shè)NFH小鼠模型，于應(yīng)用激素同時(shí)B組灌服生理鹽水10 mL/(kg·d)，C組灌服六味地黃丸2g/(kg·d)至處死；A組小鼠不制備模型，同時(shí)間點(diǎn)肌肉注射及灌服等量生理鹽水。處理后觀察小鼠一般情況，于第1次激素注射后2、4、8周處死小鼠，大體觀察股骨頭，取雙側(cè)股骨頭及肝臟行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察，TUNEL法檢測骨細(xì)胞凋亡情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

4、采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，P值＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:一般情況及大體觀察：第一次腹腔注射馬血清后所有小鼠均無明顯變化；第二次腹腔注射馬血清后約6小時(shí)，B、C組小鼠出現(xiàn)食量減少、萎靡、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)少等現(xiàn)象，C組小鼠約1周后逐步好轉(zhuǎn)，B組小鼠約2周后逐步好轉(zhuǎn)，A組小鼠無明顯變化。B組小鼠于第二次腹腔注射馬血清后7d、11d各死亡一只，C

5、組小鼠于第二次腹腔注射馬血清后10min死亡一只，余小鼠均存活至實(shí)驗(yàn)完成。3組動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)股骨頭外觀形態(tài)均正常，關(guān)節(jié)軟骨面均光滑、平整，色澤無異常。
　　 HE染色觀察：A組各時(shí)間點(diǎn)肝臟均正常；股骨頭骨小梁粗大、完整，排列規(guī)則，骨細(xì)胞清晰可見，偶見空骨陷窩，髓間脂肪細(xì)胞相對(duì)較少，形態(tài)正常，造血細(xì)胞豐富。B組第1次激素注射后2周時(shí)肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞內(nèi)可見小脂肪空泡，肝索結(jié)構(gòu)不清，肝竇變窄；第1次激素注射后2周時(shí)見骨小梁較正常變細(xì)，部

6、分?jǐn)嗔?，骨?xì)胞空骨陷窩增多，部分骨細(xì)胞邊聚、固縮，髓間脂肪細(xì)胞直徑增大，數(shù)目增多；4、8周時(shí)骨小梁變細(xì)、稀疏，斷裂處增加，可見骨碎片出現(xiàn)，空骨陷窩率增高。C組肝臟及股骨頭各時(shí)間點(diǎn)較A組變化不顯著。B組空骨陷窩率明顯高于A、C組(P＜0.01)，A、C組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 免疫組織化學(xué)染色觀察：A組各時(shí)間點(diǎn)骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)棕黃色顆粒多見、骨保護(hù)素配體(osteoproteg

7、erin ligand，OPGL)棕黃色顆粒較少，陽性染色率無明顯改變；B組第1次激素注射后2周，OPG陽性表達(dá)棕黃色顆粒偶見，OPGL陽性表達(dá)棕黃色顆粒較多，第4、8周時(shí)，陽性率降低和升高有增加趨勢；C組各時(shí)間點(diǎn)OPG棕黃色顆粒多見、OPGL棕黃色顆粒較少，隨時(shí)間延長，陽性染色率稍升高和降低，C組各時(shí)間點(diǎn)OPG、OPGL蛋白表達(dá)較A組稍降低和升高。各時(shí)間點(diǎn)B組與A、C組比較，股骨頭OPG局部表達(dá)明顯下降，OPGL局部表達(dá)明顯上升，差異

8、均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)，A、C組間OPG陽性表達(dá)水平第2周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，第4、8周時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；A、C組間OPGL陽性表達(dá)水平第2、4周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，第8周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 細(xì)胞凋亡分析顯示：B組各時(shí)間點(diǎn)均可見細(xì)胞核中出現(xiàn)較多棕黃色顆粒的陽性細(xì)胞，其凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)隨時(shí)間延長增大；A、C組各時(shí)間點(diǎn)陽

9、性細(xì)胞偶見，細(xì)胞AI無明顯改變。B組較A、C組骨細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.六味地黃丸對(duì)激素應(yīng)用導(dǎo)致的肝臟脂質(zhì)代謝紊亂具有明顯的預(yù)防作用。
　　 2.六味地黃丸具有改善骨代謝、保護(hù)骨細(xì)胞的作用，可通過抑制激素對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響，阻止骨吸收，促進(jìn)骨形成和骨修復(fù)。
　　 3.六味地黃丸可以拮抗激素對(duì)OPG和OPGL蛋白表達(dá)的影響，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，降