一種新的垂體分泌蛋白骨生成誘導(dǎo)因子的功能研究.pdf

1、該研究應(yīng)用分子生物學(xué)等技術(shù)研究了OIF的基因表達(dá)情況及pit-1轉(zhuǎn)錄因子對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控作用,并構(gòu)建了OIF原核、真核表達(dá)載體,獲得了OIF的抗體,為進(jìn)一步揭示OIF是否為垂體分泌的新激素奠定基礎(chǔ).主要內(nèi)容和結(jié)果如下:一、小鼠及人分泌蛋白骨生成誘導(dǎo)因子基因的表達(dá)及定位分析采用ICR品系的清潔級(jí)小鼠的組織來(lái)提取RNA,以GAPDH為內(nèi)標(biāo),用半定量RT-PCR方法來(lái)觀察OIF在小鼠各種組織的表達(dá)情況.二、人分泌蛋白骨生成誘導(dǎo)因子啟動(dòng)子區(qū)的

2、調(diào)控分析通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)在人OIF基因的啟動(dòng)子區(qū)域2.5kb的DNA序列中,其第二個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游700~1000bp的范圍內(nèi)有兩個(gè)Pit-1反應(yīng)元件,且兩個(gè)反應(yīng)元件之間僅相距250bp.利用凝膠阻滯試驗(yàn)(Gel-shift),在體外發(fā)現(xiàn),OIF基因啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)pit-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)均能與Pit-i轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,其中探針1與Pit-1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合較強(qiáng),進(jìn)一步應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),在體內(nèi)研究了pit-1轉(zhuǎn)錄因子對(duì)O

3、IF轉(zhuǎn)錄的調(diào)控.三、人垂體分泌蛋白骨生成誘導(dǎo)因子原核表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)及抗體制備利用RT-PCR技術(shù)從垂體中克隆到人OIF的cDNA序列,構(gòu)建成OIF核心蛋白的融合蛋白表達(dá)載體pGEX-OIF,將此重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化人大腸桿菌BL21(DE3)中,進(jìn)行原核表達(dá).四、人分泌蛋白骨生成誘導(dǎo)因子的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定借助OIF全長(zhǎng)cDNA利用PCR技術(shù)構(gòu)建了pcDNA3.1-OIF真核表達(dá)載體,此真核表達(dá)載體表達(dá)的蛋白帶有6個(gè)Histidi