一種新的hTERT相互作用蛋白的篩選及鑒定.pdf

1、目的和意義:
　　端粒-端粒酶與細(xì)胞增殖、分化及衰老等增齡相關(guān)性疾病密切相關(guān)。端粒封閉染色體末端并維持染色體的穩(wěn)定性,它隨細(xì)胞分裂增殖而成比例的丟失,從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老及死亡;端粒酶的活化,可以以其自身RNA組分(Human telomerase RNA,hTR)為模板,通過端粒酶催化亞單位(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)催化合成并延長端粒,補(bǔ)償端粒的丟失,維持基因組的穩(wěn)定

2、,從而滿足機(jī)體補(bǔ)充、修復(fù)及更新的需要。端粒酶的活性決定端粒的長度進(jìn)而控制細(xì)胞的命運(yùn),其活性異?？梢允辜?xì)胞凋亡失控、失衡或永生化,進(jìn)而可導(dǎo)致一系列增齡性疾病,如動脈硬化性心腦血管疾病、2型糖尿病、原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和腫瘤等。因此,端粒酶活性調(diào)控已成為目前的研究熱點(diǎn):誘導(dǎo)端粒酶活性,可以延長正常細(xì)胞增殖和壽命,抑制端粒酶活性,可以導(dǎo)致異常細(xì)胞凋亡和衰老。進(jìn)一步深入了解端粒酶活性調(diào)控機(jī)制可以為增齡相關(guān)性疾病的發(fā)病機(jī)理和防治機(jī)制以及制備治療性生物

3、工程細(xì)胞和干細(xì)胞等研究提供新的思路和線索。
　　端粒酶的活性調(diào)控是涉及多因子參與多水平調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程,hTERT是端粒酶活性的必需組分和關(guān)鍵限速成分,其調(diào)控涉及hTERT基因的轉(zhuǎn)錄,hTERTmRNA的適當(dāng)剪接,hTERT蛋白質(zhì)翻譯后修飾,細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)以及將全長的hTERT蛋白組裝為全酶等,這一系列細(xì)胞內(nèi)生物事件的正常發(fā)揮依賴于hTERT和其結(jié)合蛋白的相互作用,對hTERT相互作用蛋白的挖掘研究,有助于更深入探索端粒酶的結(jié)構(gòu)功能以及

4、活性調(diào)控作用機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展及其有效結(jié)合,為研究蛋白質(zhì)相互作用提供了強(qiáng)大手段,其準(zhǔn)確性高與速度快的優(yōu)點(diǎn)使免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于尋找生理條件下新的相互作用。本課題研究將免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)與串聯(lián)芯片液相質(zhì)譜(High Pressure Liquid Chromatography,Chip Hermeticity In Plastics,Mass

5、 Spectrum,HPLC-CHIP-MS-MS)有效結(jié)合,鑒定出新的hTERT相互作用蛋白原鈣粘附蛋白10(Protocadherin10,PCDH10),并對兩者的相互作用所介導(dǎo)的端粒酶活性和腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性等生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行初步研究。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)果:
　　1.免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)篩選hTERT相互作用蛋白1.1hTERT免疫共沉淀復(fù)合物的獲取、分離和質(zhì)譜鑒定
　　首先獲取經(jīng)行“雙側(cè)睪丸切除術(shù)”的前列

6、腺癌患者的新鮮睪丸組織,病理證實(shí)為正常睪丸組織;Lysis/WashBuffer裂解獲得睪丸組織總蛋白;采用Co-IPKit利用抗人hTERT單抗免疫共沉淀睪丸組織總蛋白(以IgG為對照抗體),獲得hTERT免疫共沉淀復(fù)合物;經(jīng)WesternBlotting證實(shí)免疫共沉淀復(fù)合物中hTERT的存在,而對照組中沒有,同時經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離hTERT免疫共沉淀復(fù)合物,考馬斯亮藍(lán)染色顯示與對照組IgG相比,有hTERT蛋白條帶(約1

7、20KD)及目的特異性條帶存在,證明此法可行;切取2條差異條帶經(jīng)膠內(nèi)酶解后,通過HPLC-CHIP-MS-MS在高可信度Valid模式下鑒定為PCDH10和SP1。SP1為已報道的hTERT激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,因此我們選擇新的hTERT相互作用蛋白PCDH10進(jìn)行下一步研究。
　　1.2hTERT和PCDH10相互作用的免疫共沉淀體內(nèi)驗證
　　分別選用抗人hTERT單抗(或抗人PCHD10單抗)進(jìn)行Co-IP(以不加抗體為對

8、照),然后以抗人PCHD10單抗(或抗人hTERT單抗)進(jìn)行WesternBlotting檢測,結(jié)果顯示以hTERT單抗免疫共沉淀復(fù)合物中有PCDH10的存在,而以PCDH10單抗免疫共沉淀復(fù)合物中有hTERT的存在,再一次驗證兩者的相互作用,證明質(zhì)譜結(jié)果的真實(shí)性。
　　2.PCDH10和hTERT相互作用對端粒酶活性的影響2.1腺病毒Ad-PCDH10的構(gòu)建、包裝及擴(kuò)增
　　采用RT-PCR從睪丸組織中擴(kuò)增PCDH10基因

9、全長片段,連接至中間載體pTA2,經(jīng)酶切及測序鑒定正確;KpnI和XbaI同時雙酶切PCDH10的基因序列和腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV,T4連接酶連接后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,獲取重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-PCDH10;經(jīng)PmeI線性化后在含pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)中進(jìn)行同源重組,獲得重組腺病毒載體pAdEasy-PCDH10;轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行包裝、擴(kuò)增,第5代獲得滴度較高的腺

10、病毒,命名為Ad-PCDH10。
　　2.2PCDH10和hTERT相互作用對端粒酶活性的影響
　　以端粒酶強(qiáng)陽性的體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞為研究對象,腺病毒Ad-PCDH10和腺病毒空載Ad感染人胰腺癌細(xì)胞HS766T,同時設(shè)置未感染對照組。Real-TimePCR和WesternBlotting分別檢測HS766T細(xì)胞中PCDH10的mRNA和蛋白表達(dá)水平表明:轉(zhuǎn)染PCDH10基因后,與腺病毒空載對照組和未感染對照組相比,PCD

11、H10基因表達(dá)明顯上調(diào),蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01),證明腺病毒感染有效。
　　(1)Real-TimePCR和WesternBlotting分別檢測HS766T細(xì)胞中hTERT的mRNA和蛋白表達(dá)水平表明:轉(zhuǎn)染PCDH10基因后,hTERT的mRNA和蛋白表達(dá)水平較腺病毒空載對照組和未感染對照組無明顯變化(P>0.05),表明PCDH10對hTERT的表達(dá)沒有影響;
　　(2)以抗人PCDH10單抗免疫共沉淀HS766

12、T細(xì)胞總蛋白,WesternBlotting檢測hTERT存在于轉(zhuǎn)染PCDH10的免疫共沉淀復(fù)合物中,同時TRAP-非變性PAGE-銀染法檢測端粒酶活性提示:轉(zhuǎn)染PCDH10基因組的端粒酶活性較腺病毒空載對照組和未感染對照組明顯降低(P<0.01),而后兩者端粒酶活性無明顯差異(P>0.05),表明PCDH10與hTERT相互作用能明顯抑制端粒酶活性。
　　3.PCDH10對腫瘤細(xì)胞增殖、周期、遷移和侵襲等生物學(xué)特性的影響

13、　　腺病毒Ad-PCDH10和腺病毒空載Ad感染HS766T,同時設(shè)置未感染對照組。3.1PCDH10轉(zhuǎn)染對HS776T細(xì)胞增殖活性的影響
　　轉(zhuǎn)染PCDH10基因24h,48h,72h,96h,120h,144h后,CCK-8細(xì)胞增殖檢測各組細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示:腺病毒空載對照組與未轉(zhuǎn)染組比較,HS776T細(xì)胞增殖率無明顯改變(P>0.05),表明腺病毒空載體轉(zhuǎn)染對HS776T細(xì)胞的增殖活性無影響;與腺病毒空載對照組相比,轉(zhuǎn)染

14、PCDH10組的細(xì)胞增殖率逐漸下降,表明PCDH10對HS766T細(xì)胞增殖起抑制作用,并呈時間依賴性,轉(zhuǎn)染96h增殖率下降12.73％(P<0.05);轉(zhuǎn)染120h增殖率下降19.87%(P<0.01);轉(zhuǎn)染144h增殖率最低,抑制最強(qiáng),下降30.14%(P=0.000)。
　　3.2PCDH10轉(zhuǎn)染對HS776T細(xì)胞周期的影響
　　轉(zhuǎn)染PCDH10基因72h,流式細(xì)胞儀DNA含量分析法檢測各組細(xì)胞周期。結(jié)果顯示:與未感染組

15、和腺病毒空載組比較,PCDH10組細(xì)胞增殖期(S、G2/M期)細(xì)胞和靜止期(G0、G1期)各細(xì)胞周期比例均無明顯變化(P>0.05),表明PCDH10對HS776T的細(xì)胞周期沒有影響。
　　3.3PCDH10轉(zhuǎn)染對HS776T細(xì)胞遷移能力的影響
　　轉(zhuǎn)染PCDH10基因24h,48h后,采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗測定細(xì)胞遷移能力。結(jié)果顯示:與未感染組比較,腺病毒空載組24h和48h細(xì)胞的遷移率無明顯差異(P>0.05),表明腺病毒空載

16、轉(zhuǎn)染對HS776T細(xì)胞的遷移活性無影響;而轉(zhuǎn)染PCDH10基因組劃痕處的HS776T細(xì)胞的遷移明顯受抑制,24h和48h細(xì)胞的遷移率較腺病毒空載對照組明顯下降(P<0.01),分別下降30.07%和52.95%(P=0.000),表明PCDH10能明顯抑制HS776T細(xì)胞的遷移能力。
　　3.4PCDH10轉(zhuǎn)染對HS776T細(xì)胞侵襲能力的影響
　　轉(zhuǎn)染PCDH10基因24h,采用Transwell實(shí)驗測定細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果顯

17、示:與未感染組比較,腺病毒空載組細(xì)胞24h穿過Matrigel膠及Transwell膜的細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P>0.05),表明腺病毒空載體轉(zhuǎn)染對HS776T細(xì)胞的侵襲活性無影響;而轉(zhuǎn)染PCDH10基因組與腺病毒空載組相比,HS776T細(xì)胞侵襲重建基底膜能力受到顯著的抑制,穿過Matrigel膠及Transwell膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01),侵襲活性下降58.56%(P=0.000),表明PCDH10能明顯抑制HS776T細(xì)胞侵襲

18、能力。
　　結(jié)論:
　　綜上所述,本課題首次從正常人睪丸組織中成功篩選和鑒定出新的hTERT相互作用蛋白PCDH10,并在體內(nèi)驗證hTERT和PCDH10間存在相互作用;其次通過在端粒酶強(qiáng)陽性的腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)PCDH10,體外實(shí)驗初步闡明PCDH10對hTERT表達(dá)無影響,而它與hTERT相互作用抑制端粒酶活性;最后明確PCDH10在體外具有抑制腫瘤細(xì)胞生長,降低腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲等細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng);同時推測外源性過表達(dá)PC