色鹽桿菌DSM22428T新種鑒定及其甜菜堿醛脫氫酶研究.pdf

1、菌株DSM22428T是本實(shí)驗(yàn)室從東營(yíng)濱海鹽地堿蓬分離的一株內(nèi)生中度嗜鹽菌，其可生長(zhǎng)的NaCl濃度范圍為0.6–20％（w/v），比嗜鹽古菌有更廣的耐鹽范圍，對(duì)外界鹽濃度的劇烈變化有更好的適應(yīng)性。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究證實(shí)，菌株DSM22428T在高鹽條件下可通過在細(xì)胞內(nèi)積累滲透保護(hù)劑甘氨酸甜菜堿來抵抗外界的滲透脅迫，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透平衡。甘氨酸甜菜堿是細(xì)菌，植物，動(dòng)物最有效的無毒滲透保護(hù)劑，目前已經(jīng)對(duì)植物中的betB進(jìn)行了深入研究，且為植

2、物抗逆工程的重點(diǎn)。BADH基因序列在不同的物種中有較大差異，因此賦予菌株抗?jié)B透脅迫能力也不相同。細(xì)菌以膽堿為底物經(jīng)膽堿脫氫酶CDH和甜菜堿醛脫氫酶BADH催化合成甘氨酸甜菜堿，而甜菜堿醛脫氫酶BADH是甘氨酸甜菜堿合成的關(guān)鍵酶。此外，甜菜堿醛脫氫酶還在病原菌入侵宿主時(shí)發(fā)揮重要的作用。因此對(duì)DSM22428T甜菜堿醛脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究有助于深入了解甜菜堿醛脫氫酶的特點(diǎn)，對(duì)于進(jìn)一步明確該菌的抗鹽機(jī)理有重要意義。同時(shí)經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)菌株D

3、SM22428T應(yīng)屬于色鹽桿菌屬的一個(gè)新種，相關(guān)鑒定工作已經(jīng)開展。但是隨著分子鑒定在細(xì)菌新種鑒定中的作用越來越大，DNA雜交、脂肪酸、極脂分析等已經(jīng)成為必要的項(xiàng)目，因此對(duì)DSM22428T進(jìn)行更多的分子鑒定對(duì)于確定其在鹽單胞菌科中的分類地位是十分必要的。
　　本文首先將色鹽桿菌DSM22428T甜菜堿醛脫氫酶基因betB在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)及功能驗(yàn)證，然后進(jìn)行了酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究，最后對(duì)色鹽桿菌DSM22428T進(jìn)行了新

4、種的鑒定。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.根據(jù) GenBank中色鹽桿菌DSM22428T甜菜堿醛脫氫酶基因 betB序列，設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物，以色鹽桿菌DSM22428T總DNA為模板擴(kuò)增獲得 betB基因的全序列，雙酶切后連接到表達(dá)載體 pET-15b上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，在重組大腸桿菌中成功進(jìn)行了甜菜堿醛脫氫酶的異源表達(dá)。在不同 NaCl濃度梯度基本培養(yǎng)基中添加終濃度為1mM的膽堿，接種色鹽桿菌DSM22428T

5、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和對(duì)照相比，在鹽脅迫條件下，外界提供一定濃度的膽堿，可以明顯提高野生菌株的耐鹽能力，說明野生菌株甜菜堿醛脫氫酶具有明顯的滲透調(diào)節(jié)功能。為了進(jìn)一步驗(yàn)證異源表達(dá)的甜菜堿醛脫氫酶是否具有滲透調(diào)節(jié)功能，在不同 NaCl濃度梯度的LB培養(yǎng)基中添加終濃度為1mM的膽堿，接種重組大腸桿菌，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶有 betB基因的重組大腸桿菌生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)高于帶空質(zhì)粒的對(duì)照組，尤其在高鹽條件下效果更加明顯，色鹽桿菌DSM22428T甜菜堿

6、醛脫氫酶基因 betB的導(dǎo)入顯著提高了重組大腸桿菌的耐鹽性，說明異源表達(dá)的色鹽桿菌DSM22428T甜菜堿醛脫氫酶同樣具有滲透調(diào)節(jié)功能。
　　2.用0.3mM的IPTG低溫誘導(dǎo)重組大腸桿菌過量表達(dá)甜菜堿醛脫氫酶蛋白，高壓勻漿機(jī)破碎菌體細(xì)胞，并通過鎳柱親和層析、離子交換層析、分子篩柱層析進(jìn)行蛋白純化。最終得到了較純的目的蛋白，蛋白濃度約為1.5mg/ml，單體分子量在61KDa左右，與生物信息學(xué)分析的DSM22428T甜菜堿醛脫氫酶

7、分子量相同。
　　3.將提純的甜菜堿醛脫氫酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，經(jīng)測(cè)定酶的最適pH為7.5，酶的比活為3.6×10-2 U/mg。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)該酶具有耐鹽性，鹽濃度為2M時(shí)，該酶仍保留40%左右的酶活，說明該酶具有較強(qiáng)的抗高鹽濃度的能力。
　　4.按照 Halomonadaceae科菌種鑒定的最小標(biāo)準(zhǔn)對(duì)菌株 DSM22428T進(jìn)行分類學(xué)研究。菌株DSM22428T鹽濃度生長(zhǎng)范圍為0.6–20%（w/v）（最適鹽濃度為5-6%，

8、w/v），生長(zhǎng)溫度為5-45 oC(最適溫度為35℃)，生長(zhǎng) pH范圍為5-9(最適 pH為7-8)，可積累聚-β-羥丁酸和產(chǎn)胞外多糖。主要含有的脂肪酸為 summed feature3(C16:1ω7c/C15:0 iso2-OH，23.1%)，C18:1ω7c(22.6%)和C16:0(22.3%)。主要的呼吸醌為泛醌 Q-9(86%)。主要的極性脂為：磷脂酰乙醇胺 PE；磷脂酰甘油PG；一種未知糖脂GNL；一種未知糖磷脂PGNL；

9、雙磷脂酰甘油DPG；一種未知脂類L；一種未知氨基脂AL。16S rRNA基因序列及級(jí)聯(lián)的16S rRNA，gyrB，rpoD基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示菌株DSM22428T屬于色鹽桿菌屬的新種。其最相近菌株為Chromohalobacter israelensis DSM6768T(95.4%16S rRNA序列相似性)。菌株DSM22428T與 C. israelensis DSM6768T，C. salexigens DSM3043T