乙醇脫氫酶高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）通常以NAD＋、NADP＋或PQQ為輔酶，是一類氧化還原酶。本研究在篩選ADH高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，對(duì)菌株的發(fā)酵條件、ADH提取純化和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，主要研究結(jié)果如下：
　　1.ADH高產(chǎn)菌株的篩選。利用產(chǎn)酸顯示平板、水解碳酸鈣透明圈法和以乙醇為唯一的碳源等篩選模型，篩選出一株ADH產(chǎn)量為4995U/mg，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)、16SrDNA序列分析，鑒定為葡糖醋桿菌

2、，命名為Gluconacetobacter sp.TDY1。
　　2.菌株TDY1生長(zhǎng)和產(chǎn)酶條件研究。單因素試驗(yàn)得出優(yōu)化培養(yǎng)基為1.5%葡萄糖、2.0%復(fù)合氮源（酵母膏+牛肉膏）、0.4%氯化鈣和0.4%有機(jī)酸；菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)最佳條件為初始pH6.0、接種量8%、裝液量30mL/300mL、25℃條件下培養(yǎng)20h。經(jīng)Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件為葡萄糖1.54%、復(fù)合氮源2.02%、裝液量48.70mL和乳酸0.42

3、%，菌株TDY1酶活達(dá)7191U/mg。
　　3.菌株TDY1胞內(nèi)ADH的提取純化。分別用超聲破碎法、反復(fù)凍融法、溶菌酶法和細(xì)菌裂解液法等4種不同破壁方法對(duì)菌株TDY1進(jìn)行破壁處理，通過比較細(xì)胞的破碎率和ADH的活力，確定適合于菌株TDY1的細(xì)胞破壁方法和最佳條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超聲破碎法獲得的ADH活力為4004U/mg，破壁率為97.3%，與其他3種方法比較差異極顯著（P＜0.01）。使用正交設(shè)計(jì)對(duì)超聲破碎法的破壁條件進(jìn)行優(yōu)化，

4、超聲破碎的最佳條件為：超聲9s、間隔18s、破碎總時(shí)間75s、功率95W。菌株TDY1中ADH經(jīng)超聲破碎法、硫酸銨鹽析沉淀、透析和DEAE-52陰離子交換層析處理后，純化倍數(shù)8.7倍，酶活回收率為38.7％。純化后的ADH，經(jīng)SDS-PAGE初步確定其亞基分子量為48KDa。
　　4.ADH的部分酶學(xué)性質(zhì)研究。菌株TDY1的ADH最適氧化反應(yīng)pH9.0，pH穩(wěn)定范圍8-9；最適反應(yīng)溫度70℃，在10-60℃溫度范圍酶活穩(wěn)定。最適底