半胱天冬酶-8在腎癌中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、目的：半胱天冬酶-8是否能在腎癌中表達(dá)并存在表達(dá)水平的改變。半胱天冬酶-8表達(dá)水平是否與腎癌的類型、病理分期、組織學(xué)分級(jí)及轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)。采用缺口末端標(biāo)記法研究腎癌患者腎細(xì)胞凋亡情況并與Caspase-8表達(dá)作相關(guān)分析。通過從細(xì)胞凋亡的角度了解腎癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的途徑，有助于判斷腎癌的預(yù)后，有可能為腎癌的基因治療找到新的靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 研究對(duì)象分為：研究組、對(duì)照組。
　　 研究組：腎癌患者，40例。癌

2、旁組織，40例。
　　 對(duì)照組：正常腎組織，共10例。
　　 1、缺口末端標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡
　　 采用缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）原位標(biāo)記凋亡細(xì)胞核，以PBS為陰性對(duì)照，按該試劑盒說明操作（武漢博士德生物工程有限公司）。每組觀察4孔（六孔板），每孔計(jì)數(shù)10個(gè)20×視野（每個(gè)視野計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞核，凋亡陽性細(xì)胞核呈棕黃色、非凋亡細(xì)胞核呈藍(lán)色）。根據(jù)公式（凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞計(jì)數(shù)×100％）計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)（

3、apoptotic index，AI），取其均值。
　　 2、免疫組化sp法檢測Caspase-8表達(dá)
　　 試劑和方法：鼠抗人Caspase-8單克隆抗體（福建邁新生物技術(shù)公司），工作濃度1：100，sp免疫組化試劑盒（福建邁新生物技術(shù)公司），sp免疫組化染色按說明書進(jìn)行，0.1mol/L，枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)抗原（98℃、5min）。
　　 結(jié)果判定：Caspase-8陽性判定：以0.1moI/LPBS替代-

4、抗體作為空白對(duì)照，用已知胃癌Caspase-8陽性表達(dá)片作為陽性對(duì)照，腎癌細(xì)胞漿或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為Caspase-8染色陽性，參照Caide等的計(jì)數(shù)方法，400倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野，陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％，表達(dá)陽性程度：5％-25％為（+），26％-50％為（2+），51％-75％為（3+），>75％為（4+），切片中陽性細(xì)胞數(shù)≥5％為陽性表達(dá)，<5％為陰性表達(dá)。
　　 Caspase-8表達(dá)量：所有

5、免疫組化切片于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)由操作人員在單盲情況下于顯微鏡下觀察，以SECOM攝像頭將病理切片上的腎癌圖像采集入計(jì)算機(jī)，PIPS-2020超清晰彩色病理圖文系統(tǒng)行Caspase-8表達(dá)定量分析。計(jì)算公式如下：
　　 PU=100×（Ga-GA）/[（1-AAa）×Gmax]
　　 式中AAa=n/（n+m），Gmax為測試儀器最大灰度分級(jí)，n為陽性反應(yīng)組織面積，m為背景面積，GA為平均灰度級(jí)，Ga為陽性反應(yīng)組織灰度級(jí)。

6、>　　 結(jié)果：
　　 1、臨床資料
　　 40例研究對(duì)象，其中男性27例，女性13例，平均年齡53歲。透明細(xì)胞癌13例，乳頭狀細(xì)胞癌12例，混合癌8例，其他腎細(xì)胞癌（腎癌）7例。17例無癌轉(zhuǎn)移，22例有癌轉(zhuǎn)移。病理分期Ⅰ期11例，Ⅱ期12例，Ⅲ期10例，Ⅳ期7例。組織學(xué)分級(jí)為高分化13例，中分化17例，低分化10例。
　　 正常腎對(duì)照組10例，其中男性7例，女性3例，平均年齡50歲。
　　 病例組與對(duì)照

7、組以及各亞組年齡、性別無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。
　　 2、腎癌組織細(xì)胞凋亡情況研究
　　 采用缺口末端標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡指數(shù)（AI）。腎癌組織Caspase-8表達(dá)陽性AI為7.5±2.3，Caspase-8表達(dá)陰性AI為3.8±1.6，腎癌組織Caspase-8表達(dá)陽性者AI明顯高于Caspase-8表達(dá)陰性者，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理（T檢驗(yàn)），P<0.01。提示腎癌組織存在細(xì)胞凋亡異常。
　　 3、

8、腎組織細(xì)胞caspase-8表達(dá)研究
　　 采用免疫組化sp法檢測Caspase-8表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腎癌患者癌組織、癌旁組織、正常腎組織細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒，呈彌漫分布，呈Caspase-8陽性表達(dá)，提示正常細(xì)胞與癌組織細(xì)胞均能表達(dá)caspase-8。
　　 正常腎組織（對(duì)照組），癌旁組織和腎癌中caspase-8的陽性表達(dá)率分別為100％（10/10），100％（40/40），90％（36/40），經(jīng)x2檢驗(yàn)，正常腎

9、組織（對(duì)照組）和癌旁組織與腎癌組織caspase-8表達(dá)的陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 腎癌中caspase-8的表達(dá)強(qiáng)度2例4+，4例3+，14例2+，16例1+，4例（-）。癌旁組織中caspase-8的表達(dá)強(qiáng)度：1例4+，19例3+，14例2+，6例1+。正常腎組織（對(duì)照組）caspase-8的表達(dá)強(qiáng)度：7例4+，3例3+。三組的caspase-8的表達(dá)強(qiáng)度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Friedman

10、X2=51.61，P<0.01），兩兩之間的秩和檢驗(yàn)，caspase-8的表達(dá)強(qiáng)度正常腎組織最高，癌旁組織次之，癌組織最低（P<0.01）。
　　 Caspase-8表達(dá)量，正常腎組織為27.02±6.48，癌旁組織15.74±4.02，癌組織10.81±7.67，caspase-8的表達(dá)量正常腎組織最高，癌旁組織次之，癌組織最低，經(jīng)F檢驗(yàn)，F(xiàn)=81.65，P<0.01。兩兩之間的q檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。提示

11、腎癌組織存在Caspase-8表達(dá)改變。
　　 4、不同腎癌類型、病理分期、組織學(xué)分級(jí)及轉(zhuǎn)移情況caspase-8表達(dá)研究
　　 透明細(xì)胞癌，乳頭狀細(xì)胞癌（嗜色細(xì)胞，顆粒細(xì)胞癌），混合癌，其他腎細(xì)胞癌，四個(gè)類型caspase-8表達(dá)強(qiáng)度的比較通過統(tǒng)計(jì)學(xué)kruskal-wallis秩和檢驗(yàn)（kruskal-wallis x2=0.44，P>0.05）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示caspase-8表達(dá)與腎癌類型無明顯關(guān)聯(lián)。

12、　　 腎癌的病理分期與caspase-8表達(dá)強(qiáng)度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)spearman等級(jí)相關(guān)分析得出相關(guān)系數(shù)r=-0.60，有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。提示腎癌病理分期越高，caspase-8表達(dá)越低。
　　 腎癌的組織學(xué)分級(jí)與caspase-8表達(dá)強(qiáng)度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)spearman等級(jí)相關(guān)分析得出相關(guān)系數(shù)r=-0.60，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示腎癌組織學(xué)分級(jí)越低，caspase-8表達(dá)率越低。
　　 22例轉(zhuǎn)移腎癌的c

13、aspase-8表達(dá)強(qiáng)度為：2例2+，16例+，4例-；17例未轉(zhuǎn)移腎癌的caspase-8表達(dá)強(qiáng)度為：2例4+，4例3+，11例2+。兩組caspase-8表達(dá)強(qiáng)度的比較通過統(tǒng)計(jì)學(xué)wilcoxon秩和檢驗(yàn)（Z=3.46，P<0.01）差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示caspase-8表達(dá)與腎癌轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)，有轉(zhuǎn)移者caspase-8表達(dá)強(qiáng)度低于未轉(zhuǎn)移的。
　　 5、腎癌組織凋亡指數(shù)與Caspase-8表達(dá)的相關(guān)研究
　　 通過

14、spearman的相關(guān)分析得出凋亡指數(shù)與Caspase-8的相關(guān)系數(shù)為0.36461（p<0.05）。提示凋亡指數(shù)與caspase-8的表達(dá)量成正相關(guān)，腎癌組織的凋亡指數(shù)低，caspase-8的表達(dá)量也低。
　　 結(jié)論：
　　 1、caspase-8能在腎癌、癌旁組織與正常腎細(xì)胞中表達(dá)。
　　 2、與正常腎細(xì)胞比較，腎癌組織、癌旁組織caspase-8的表達(dá)下調(diào)，尤以腎癌組織明顯。
　　 3、腎癌惡性程度

15、越大，caspase-8表達(dá)下調(diào)越明顯。
　　 4、與非轉(zhuǎn)移腎癌比較，轉(zhuǎn)移腎癌caspase-8表達(dá)明顯下調(diào)。
　　 5、caspase-8表達(dá)與不同腎癌類型無明顯相關(guān)聯(lián)。
　　 6、不同腎癌病理分期caspase-8的表達(dá)存在差異，病理分期越低，caspase-8表達(dá)越高。
　　 7、腎癌組織存在細(xì)胞凋亡異常，腎癌組織Caspase-8表達(dá)陽性者AI明顯高于Caspase-8表達(dá)陰性者，凋亡指數(shù)與cas