兩種蛇毒中抗補(bǔ)體活性成分的篩選及研究.pdf

1、目 的：對(duì)中華眼鏡蛇毒和烙鐵頭蛇毒進(jìn)行抗補(bǔ)體活性篩選，以期從中發(fā)現(xiàn)新的抗補(bǔ)體蛋白，并對(duì)其分離純化、理化性質(zhì)和抗補(bǔ)體活性加以研究，對(duì)其可能的應(yīng)用前景加以評(píng)價(jià)。 研究方法：1.采用SP Sephadex C-25離子交換柱層析和RP-HPLC從中華眼鏡蛇（Naja atra）蛇毒中分離純化目標(biāo)蛋白；采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和MALDI-TOF-MS對(duì)目標(biāo)蛋白的表觀分子量、精確分子量和純度進(jìn)行測(cè)定；等電聚焦電泳法

2、測(cè)定等電點(diǎn)；Edman降解法對(duì)其N端序列進(jìn)行部分測(cè)定；測(cè)定目的蛋白對(duì)補(bǔ)體經(jīng)典途徑和替代途徑溶血的抑制活性；采用綿羊紅細(xì)胞、豚鼠紅細(xì)胞和兔紅細(xì)胞測(cè)定目標(biāo)蛋白的溶血活性；采用MTT法測(cè)定對(duì)腫瘤細(xì)胞K562細(xì)胞株的抗腫瘤作用，SRB法測(cè)定對(duì)腫瘤細(xì)胞A549和MCF-7細(xì)胞株的抗腫瘤作用；采用KB平板擴(kuò)散法測(cè)定抗菌活性；測(cè)定目的蛋白對(duì)經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶形成的影響，判斷其可能的作用機(jī)制。 2．采用Q Sepharose Fast Flow

3、陰離子交換柱層析、SP Sephadex C-25陽(yáng)離子交換柱層析、Sephacryl S-200凝膠柱層析、1ml Hitrap SP HP、1ml Hitrap SP HP、1ml Hitrap Heparin HP和Superdex 75凝膠柱層析對(duì)國(guó)產(chǎn)烙鐵頭蛇（Trimeresurus mucrosquamatus）蛇毒中的抗補(bǔ)體成分進(jìn)行分離，并同時(shí)測(cè)定各初分峰的纖維蛋白原水解活性及精氨酸酯酶等生物活性。 結(jié)

4、 果：1.從中華眼鏡蛇毒中分離出一個(gè)新的抗補(bǔ)體蛋白，精確分子量為7kD，等電點(diǎn)為9.81；N端序列結(jié)果表明與細(xì)胞毒素有較高的同源性；抗補(bǔ)體活性測(cè)定表明，它對(duì)正常人血清補(bǔ)體經(jīng)典途徑的激活抑制作用較明顯，而對(duì)替代途徑抑制作用較弱，同時(shí)對(duì)豚鼠和大鼠血清補(bǔ)體經(jīng)典途徑的激活抑制不明顯，機(jī)制研究表明，主要通過(guò)抑制經(jīng)典途徑中C3轉(zhuǎn)化酶形成達(dá)到抗補(bǔ)體作用。而溶血測(cè)定表明對(duì)綿羊紅細(xì)胞和兔紅細(xì)胞都沒(méi)有溶血作用，對(duì)豚鼠紅細(xì)胞有輕微的溶血作用；同時(shí)對(duì)K56

5、2、A549、MCF-7細(xì)胞株有抑制作用；對(duì)枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的生長(zhǎng)有抑制作用； 2．對(duì)烙鐵頭蛇毒中的抗補(bǔ)體活性成分進(jìn)行了初步的分離。其中粗毒經(jīng)Q Sepharose Fast Flow離子交換層析后的分離峰中，峰1具有抗補(bǔ)體活性；峰1～6具有纖維蛋白原水解活性、精氨酸酯酶活性、水腫活性；峰1～4具有出血活性、峰1、3～6有抗凝活性。 結(jié) 論：1.兩種蛇毒中均存在抗補(bǔ)體活性成分。 2．從中華

6、眼鏡蛇毒中首次分離純化出一個(gè)分子量為7kD的新的抗補(bǔ)體蛋白，它對(duì)補(bǔ)體的抑制作用呈現(xiàn)一定的種屬依賴性，對(duì)正常人血清中補(bǔ)體經(jīng)典途徑的抑制作用較明顯，而對(duì)豚鼠和大鼠血清中補(bǔ)體經(jīng)典途徑的抑制不明顯。通過(guò)對(duì)其理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的研究，為進(jìn)一步的深入研究提供了依據(jù)和參考，同時(shí)，對(duì)其開(kāi)展結(jié)構(gòu)與功能的研究也有助于抗補(bǔ)體肽類藥物的設(shè)計(jì)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 3．通過(guò)對(duì)烙鐵頭蛇毒中抗補(bǔ)體活性成分的分離條件的摸索以及粗分峰多種生物活性的測(cè)定，為下一