RNA干擾技術(shù)調(diào)控青光眼術(shù)區(qū)纖維化的研究.pdf

1、目的：青光眼是以病理性高眼壓、進(jìn)行性視神經(jīng)變性和視野缺損為特征的，位列全球第二位不可逆性致盲眼病。目前青光眼濾過(guò)性手術(shù)是治療青光眼的最主要手段之一，手術(shù)失敗的最主要原因?yàn)闉V過(guò)道的疤痕化，隨著一些抗代謝藥物如5-Fu、MMC等的應(yīng)用，抗青光眼濾過(guò)手術(shù)的成功率已大大提高，但隨之帶來(lái)一些不可避免的并發(fā)癥：濾過(guò)泡滲漏、低眼壓、眼球感染、低壓性眼病等等，嚴(yán)重影響了濾過(guò)性手術(shù)的效果，并進(jìn)一步加重視功能損害。因此，尋找新的調(diào)控術(shù)區(qū)疤痕化同時(shí)又不影響創(chuàng)

2、口愈合的平衡調(diào)控方法是抗青光眼濾過(guò)性手術(shù)成功的關(guān)鍵。 本研究探討應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，特異性地抑制IKKB的表達(dá)，從而下調(diào)NF-κB的活性，降低細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的分泌，平衡調(diào)控青光眼術(shù)區(qū)創(chuàng)口愈合，提高手術(shù)的成功率的可行性、安全性、有效性及其作用機(jī)制。 方法 1、正常人眼球筋膜成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定：取正常供體新鮮的Tenon's囊組織，利用組織塊培養(yǎng)法，進(jìn)行成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)，并利用光鏡、電鏡、細(xì)胞免疫組織化

3、學(xué)法鑒定人成纖維細(xì)胞； 2、設(shè)計(jì)、合成靶向IKKB基因的siRNAs，并進(jìn)行篩選得到具有高效干擾效率的siRNA； 3、利用高效的轉(zhuǎn)染試劑HiperFectTransfectionReagent將siRNA轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞，并設(shè)有不同的轉(zhuǎn)染濃度(5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM)進(jìn)行RNA干擾，同時(shí)設(shè)有空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組，然后用RT-PCR的方法檢測(cè)干擾后IKKB的mRNA表達(dá)水

4、平；用Westernblot的方法檢測(cè)IKKB的蛋白表達(dá)水平；用MTT法檢測(cè)RNA干擾后成纖維細(xì)胞增殖能力受到的影響，繪制其量效曲線；采用劃痕法檢測(cè)成纖維細(xì)胞的遷移能力； 4、采用激光共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)RNA干擾后NF-κB的活性，并采用RT-PCR的方法檢測(cè)其下游的生長(zhǎng)因子：BFGF、CTGF和基質(zhì)金屬蛋白酶：MMP-2、MMP-9，探討其抑制成纖維細(xì)胞增殖的可能機(jī)制； 5、利用靈長(zhǎng)類動(dòng)物恒河猴制作青光眼濾過(guò)性手術(shù)模

5、型，并在手術(shù)同時(shí)進(jìn)行siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染術(shù)區(qū)筋膜組織，進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)的RNA干擾治療，同時(shí)設(shè)有MMC對(duì)照組、空白對(duì)照組。分別于轉(zhuǎn)染后1d，3d，7d，14d、21d、28d、42d進(jìn)行眼壓測(cè)量，并于術(shù)后28d、42d時(shí)取標(biāo)本進(jìn)行術(shù)區(qū)組織病理學(xué)切片、Massion三色染色、天狼星紅染色偏振光檢測(cè)術(shù)后各組的膠原組織增殖情況。 結(jié)果 1、體外成功培養(yǎng)正常人眼球筋膜成纖維細(xì)胞，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，胞漿豐富，核大，生長(zhǎng)能力強(qiáng)，呈旋渦樣或羽毛

6、樣生長(zhǎng)，Vimentin染色陽(yáng)性； 2、設(shè)計(jì)合成的siRNA經(jīng)篩選獲得1條較為高效的siRNA；體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞經(jīng)RNA干擾后24小時(shí)，RT-PCR檢測(cè)顯示：IKKB的mRNA受到了抑制，抑制水平隨著轉(zhuǎn)染濃度的增大而增大，Westernblot的結(jié)果也說(shuō)明IKKB的蛋白表達(dá)也受到了抑制，也具有濃度依賴性。 3、MTT法結(jié)果示：靶向RNA干擾抑制IKKB的表達(dá)后，體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的增殖受到限制，轉(zhuǎn)染濃度為5nM、1

7、0nM、25nM、50nM、100nM、200nM時(shí)的抑制率分別為10.7％、23.3％、30.8％、51.2％、50.1％、49.6％；劃痕法檢測(cè)也顯示成纖維細(xì)胞的遷移能力受到了抑制； 4、激光共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)示靶向RNA干擾抑制IKKB后，NF-κB的活性也受到了抑制； 5、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果示：靶向RNA干擾抑制IKKB后，BFGF、CTGF、MMP-2以及MMP-9的表達(dá)均受到抑制； 6、在恒河猴濾

8、過(guò)性手術(shù)模型中，單純手術(shù)組的濾過(guò)泡存活3周，而RNA干擾組的濾過(guò)泡至少可以維持6周，結(jié)果與MMC相近似，但是沒有像MMC組那樣產(chǎn)生薄壁濾過(guò)泡，也沒有出現(xiàn)過(guò)低眼壓；病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)單純手術(shù)組術(shù)后可見結(jié)膜下有大量的成纖維細(xì)胞增殖，結(jié)膜下有大量膠原纖維形成，小血管增生；而RNA干擾組在術(shù)后結(jié)膜下膠原組織增生較少，明顯比單純手術(shù)組稀疏，但是沒有像MMC組那樣稀薄，而且在手術(shù)后6周則有少量的纖維組織增殖。 結(jié)論 1、RNA干擾技

9、術(shù)可以高效地抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白激酶β(即IKKB)的表達(dá)，而且隨著siRNA的轉(zhuǎn)染濃度的升高而抑制程度增加。 2、靶向RNA干擾抑制IKKB的表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的人眼球筋膜囊成纖維細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用；抑制率隨著siRNA的轉(zhuǎn)染濃度的增大而增大，當(dāng)siRNA的轉(zhuǎn)染濃度為50nM時(shí)，達(dá)到了體外抑制的最大值。 3、靶向RNA干擾抑制IKKB的表達(dá)，能夠抑制體外培養(yǎng)的人眼球筋膜囊成纖維細(xì)胞的增殖的機(jī)制可能是：由于IKK

10、B受到抑制，因而NF-κB的活性也受到了抑制，進(jìn)而影響了MMP-2，MMP-9的表達(dá)以及BFGF、CTGF等生長(zhǎng)因子的表達(dá)、分泌。這些生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的減少就是成纖維細(xì)胞的增殖受到抑制的直接原因。 4、靶向RNA干擾抑制術(shù)后IKKB的表達(dá)，可以明顯抑制猴眼小梁切除術(shù)后濾過(guò)區(qū)成纖維細(xì)胞的過(guò)度增生，抑制術(shù)后術(shù)區(qū)的炎癥反應(yīng)，抑制成纖維細(xì)胞合成與分泌膠原，從而獲得與MMC的作用相近似的抑制濾過(guò)區(qū)疤痕化的效果；沒有明顯的眼內(nèi)毒性，