RNA干擾技術探索CTGF在心肌纖維化中的作用.pdf

1、本文主要從以下三個部分展開論述：
　　第一部分 靶向大鼠結締組織生長因子的shRNA表達載體的構建、鑒定和篩選
　　目的:
　　構建4個靶向大鼠結締組織生長因子(CTGF)的shRNA真核表達載體,并利用RT-PCR和Western Blotting技術篩選出高效特異的RNA干擾真核表達載體。
　　方法:
　　根據(jù)大鼠CTGF mRNA序列設計并合成4對shRNA寡核苷酸片段,退火形成雙鏈并克隆進入載體 p

2、Genesil-1,進行酶切鑒定和測序分析。然后以脂質(zhì)體轉染試劑將目的質(zhì)粒轉染至大鼠心肌成纖維細胞,流式細胞技術分選出成功轉染的陽性細胞。通過RT-PCR和Western Blotting技術對成功構建的4個shRNA干擾質(zhì)粒進行有效性篩選,分析其CTGF mRNA及蛋白表達水平。
　　結果:
　　酶切證實轉錄shRNA的目的基因片段已成功克隆入載體,經(jīng)測序證明與設計完全符合;在成功轉染成纖維細胞48 h后,與空白對照組比較

3、,有3組細胞CTGF mRNA及蛋白表達水平明顯降低;而轉染非特異陰性質(zhì)粒對照組CTGF mRNA及蛋白表達水平無明顯變化。
　　結論:
　　成功構建了4個出靶向大鼠CTGF的shRNA真核表達質(zhì)粒重組體,并通過轉染心肌成纖維細胞篩選出高效特異的質(zhì)粒重組體,為進一步進行體內(nèi)外心肌纖維化的RNA干擾研究奠定了基礎。
　　第二部分 RNA干擾對大鼠體外培養(yǎng)細胞CTGF及纖維化指標的影響
　　實驗一：大鼠心肌細胞結締組

4、織生長因子的誘導表達及RNA干擾研究
　　目的:
　　探討心肌細胞對結締組織生長因子(CTGF)的基礎表達及轉化生長因子β1(TGF-β1)對其分泌的誘導作用,并進一步研究以RNA干擾技術靶向抑制CTGF對下游纖維化因子的影響。
　　方法:
　　實驗分為以下5組--組I:單純心肌細胞組;組II:TGF-β1誘導組;組III:陰性質(zhì)粒組;組IV:RNA干擾組;組V:脂質(zhì)體組。分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細胞,以5ng/

5、ml終濃度的TGF-β1對培養(yǎng)的心肌細胞進行誘導,再通過脂質(zhì)體法將靶向大鼠CTGF的shRNA干擾質(zhì)粒轉染入心肌細胞,流式細胞技術分選出成功轉染的細胞。通過RT-PCR和Western Blotting技術進一步研究各實驗組心肌細胞CTGF、纖維連接蛋白(FN)的mRNA及蛋白的表達水平。
　　結果:
　　單純心肌細胞組對CTGF、纖維連接蛋白(FN)及均有低水平的基礎分泌,在予以TGF-β1誘導后表達水平顯著升高(P<0.

6、01);而在靶向特異性RNA干擾后,上述因子的表達均被顯著抑制(P<0.01);并且纖維化因子FN的表達水平與促纖維化因子CTGF的表達顯著相關。
　　結論:
　　心肌細胞可自主低水平分泌或誘導后高表達CTGF及下游纖維化因子FN,提示心肌細胞主動參與了心肌纖維化及心臟重塑過程;而通過 RNA干擾靶向抑制 CTGF后可阻抑心肌細胞分泌下游纖維化因子,進一步提示CTGF是促心肌纖維化的關鍵性細胞因子,而RNA干擾是一種特異高效

7、的很有前途的干預手段。
　　實驗二：RNA干擾選擇性下調(diào)血管平滑肌細胞結締組織生長因子的表達
　　目的:
　　探討血管平滑肌細胞對結締組織生長因子(CTGF)的基礎分泌及轉化生長因子β1(TGF-β1)對其分泌的誘導作用,并進一步研究以RNA干擾技術靶向抑制CTGF對下游纖維化因子的影響。
　　方法:
　　分離培養(yǎng)成年大鼠血管平滑肌細胞,以5ng/ml終濃度的TGF-β1對培養(yǎng)的心肌細胞進行誘導,再通過脂質(zhì)

8、體法將靶向大鼠CTGF的shRNA干擾質(zhì)粒轉染入血管平滑肌細胞,200ug/ml終濃度的G418篩選出穩(wěn)定轉染細胞株后培養(yǎng)增殖進入后續(xù)實驗。實驗分組如下--組I:單純血管平滑肌細胞組;組II:TGF-β1刺激誘導組;組III:陰性質(zhì)粒對照組;組IV: RNA干擾組;組V:單純脂質(zhì)體組。通過RT-PCR和(或)Western Blotting技術進一步研究各實驗組心肌細胞CTGF、纖維連接蛋白(FN)的mRNA及蛋白的表達水平。
　

9、　結果:
　　血管平滑肌細胞在基礎狀態(tài)對CTGF、纖維連接蛋白(FN)均有低水平的分泌表達,5ng/ml終濃度的TGF-β1可以誘導其表達水平顯著升高(P<0.01);而在靶向特異性RNA干擾后,與誘導組比較,上述因子的表達均被顯著抑制(P<0.01);并且纖維化因子FN的表達水平與促纖維化因子CTGF的表達有顯著相關性。
　　結論:
　　血管平滑肌細胞可自主分泌CTGF及細胞外基質(zhì)成分;而通過RNA干擾靶向抑制CTG

10、F后可阻抑血管平滑肌細胞分泌下游纖維化因子。提示血管平滑肌細胞可主動參與心血管重塑及纖維化,而RNA干擾靶向沉默CTGF基因的表達可以有效干預纖維化過程。
　　第三部分 RNA干擾靶向抑制CTGF對自發(fā)性高血壓大鼠心臟纖維化的影響
　　實驗一：應用質(zhì)粒重組體轉染大鼠心肌的可行性研究
　　目的:
　　比較應用陽離子脂質(zhì)體lipofectamine2000經(jīng)不同途徑在體轉染質(zhì)粒重組體基因至大鼠心肌的可行性。
　

11、　方法:
　　構建含有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的真核表達質(zhì)粒。將22只雄性SD大鼠,隨機分為4組:陰性對照組(1組,n=4),心肌注射組(2組,n=6),尾靜脈注射組(3組,n=6),冠狀動脈灌注組(4組,n=6),分別采用心肌局部注射,尾靜脈液壓注射,冠狀動脈灌注三種不同方式實施在體心肌轉染。2~4組于轉染后2d,14d時間點各隨機處死3只大鼠,取心肌組織作快速冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察EGFP表達情況。
　　結

12、果:
　　在熒光顯微鏡下觀察EGFP表達情況,陰性對照組隱約可見淡綠色熒光,第2天各轉染組均可見明顯的綠色熒光分布于所取心臟組織。通過相應軟件分析系統(tǒng)分析,結果顯示各轉染組熒光強度較陰性對照組相比其差別均有統(tǒng)計學意義(p<0.05),心肌注射組和尾靜脈注射組間熒光強度差別無統(tǒng)計學意義(p=0.17),經(jīng)冠狀動脈灌注轉染組熒光強度較其余兩組增強7.37倍(p=0.013)。第2周轉染各組熒光強度明顯減弱,與陰性對照組差別無統(tǒng)計學意義

13、(p=0.41)。
　　結論:
　　陽離子脂質(zhì)體lipofectamine2000可有效的將質(zhì)粒重組體通過各種方式轉染心肌組織,而通過冠狀動脈灌注轉染可以明顯提高其轉染效率。
　　實驗二：RNA干擾靶向抑制CTGF對心肌纖維化的影響
　　目的:
　　研究RNA干擾技術靶向抑制結締組織生長因子(CTGF)對自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織纖維化指標的影響。
　　方法:
　　20只自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為未

14、干預的SHR組和RNA干擾(RNAi)組,并設置WKY組大鼠為正常對照。脂質(zhì)體轉染法通過冠狀動脈灌注聯(lián)合尾靜脈注射進行目標質(zhì)粒的體內(nèi)轉染,體內(nèi)RNA干擾持續(xù)進行8周,期間監(jiān)測各組大鼠血壓水平。在 RNA干擾結束后,處死大鼠獲取血液和心臟標本,計算左室重量/體重比(LVW/BW),ELISA法檢測血漿纖維連接蛋白(FN)和層粘蛋白(LN)濃度; RT-PCR和Western blotting檢測心肌組織CTGF及FN的mRNA和蛋白表達,

15、免疫組化技術分析CTGF及FN的空間表達。天狼星紅染色及羥脯氨酸測定分析心肌組織膠原類型及代謝水平。
　　結果:
　　RNA干擾組血壓水平和LVW/BW較SHR組無明顯差異(P>0.05),RNA干擾顯著下調(diào)CTGF及FN的mRNA和蛋白表達(P<0.01);免疫組化顯示了同樣的抑制效應,而且觀察到CTGF及FN不同的空間表達,CTGF主要存在于心肌細胞,而FN主要在心肌間質(zhì)表達。天狼星紅染色顯示 RNA干擾組膠原沉積減少,