擬除蟲菊酯對(duì)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的神經(jīng)毒性機(jī)制.pdf

1、黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路是基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路中的一個(gè)重要旁路，能通過影響基底節(jié)的直接和間接環(huán)路的活動(dòng)，而調(diào)節(jié)基底節(jié)的輸出。多巴胺對(duì)直接環(huán)路是興奮效應(yīng)，對(duì)間接環(huán)路是抑制效應(yīng)，兩者最終結(jié)果都是易化運(yùn)動(dòng)，從而巧妙地平衡錐體外系運(yùn)動(dòng)功能。PD、HD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，與黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路受損有關(guān)。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠服用含百草枯的殺蟲劑后其中腦兒茶酚胺水平降低；PD發(fā)病率與當(dāng)?shù)貧⑾x劑的銷售量及伐木場、蔬菜場的分布呈明顯的劑

2、量—效應(yīng)相關(guān)趨勢。Semchuk等以人群為基礎(chǔ)的病例—對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，除草劑和殺蟲劑的使用是PD的危險(xiǎn)因素，且與田間勞動(dòng)生活的時(shí)間長短呈劑量—反應(yīng)關(guān)系，但在控制可能的混雜因素后殺蟲劑使用為唯一的危險(xiǎn)因素。Bloomquist及同事發(fā)現(xiàn)，殺蟲劑對(duì)黑質(zhì)紋狀體多巴胺能旁路具有特異性的作用。因此，本次研究特異性地選擇黑質(zhì)紋狀體通路，系統(tǒng)的研究擬除蟲菊酯對(duì)多巴胺能通路的影響，進(jìn)一步完善擬除蟲菊酯的神經(jīng)毒性機(jī)制，為其預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

3、第一部分?jǐn)M除蟲菊酯對(duì)大鼠腦黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的影響 目的：初步探討擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對(duì)雄性SD大鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)的毒性作用。 方法：采用不同劑量的溴氰菊酯(DM6.25、12.50mg/kg)、氯菊酯(PM200、400mg/kg)對(duì)雄性SD大鼠連續(xù)10d經(jīng)口灌胃給藥后，HPLC熒光檢測法分別檢測其黑質(zhì)、紋狀體內(nèi)多巴胺(DA)及其代謝產(chǎn)物3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、3-甲氧基4-羥基苯乙酸(H

4、VA)含量。 結(jié)果：處理各組大鼠紋狀體內(nèi)DA含量都有不同程度的下降，且12.50mg/kgDM組(6.14±0.57μg/g濕重)與對(duì)照組(9.46±1.65μg/g濕重)的差異有顯著性(P＜0.05)；200、400mg/kgPM組和6.25、12.50mg/kgDM四組的多巴胺更新率[(DOPAC+HVA)/DA]與對(duì)照組相比，分別增加了133.33％、166.67％、166.67％和266.67％，差異都有顯著性(p＜0.

5、05或p＜0.01)；而黑質(zhì)內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物水平均無明顯變化。 結(jié)論：DM可使大鼠紋狀體內(nèi)DA含量下降，PM和DM都可以使多巴胺代謝產(chǎn)物增加。 第二部分?jǐn)M除蟲菊酯對(duì)大鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)內(nèi)酪氨酸羥化酶的影響 目的：探討擬除蟲菊酯對(duì)大鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)中酪氨酸羥化酶(TH)的影響。 方法：采用不同劑量的溴氰菊酯(DM)、氯菊酯(PM)對(duì)雄性SD大鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃給藥后，HPLC-FL方法檢測TH活性；免

6、疫組化以及RT-PCR技術(shù)分別檢測各組黑質(zhì)、紋狀體內(nèi)的TH蛋白及mRNA水平。 結(jié)果：DM組黑質(zhì)和紋狀體中TH酶活性與對(duì)照組相比，均有不同程度的下降，其中DM1組分別下降了31.42％、36.72％，DM2組分別下降了76.35％、44.34％，且差異有顯著性；DM組黑質(zhì)、紋狀體內(nèi)THmRNA水平與對(duì)照組相比，均有所下降，有顯著性差異；DM2組紋狀體內(nèi)的TH蛋白水平與對(duì)照組相比，差異有顯著性，DM1組TH蛋白無顯著性差異。PM各

7、組TH活性、mRNA和蛋白與對(duì)照組相比，無顯著性差異。 結(jié)論：DM暴露可以引起大鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中TH活性、mRNA水平以及蛋白水平的下降。 第三部分?jǐn)M除蟲菊酯對(duì)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響 目的：觀察擬除蟲菊酯對(duì)大鼠紋狀體突觸體及PC12細(xì)胞多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)的作用。 方法：采用不同劑量的溴氰菊酯(DM)、氯菊酯(PM)對(duì)雄性SD大鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃給藥后，制備紋狀體突觸體懸液，采用放射標(biāo)記受體試驗(yàn)(RRA)測定

8、Py對(duì)DAT攝取功能的影響；制備正常大鼠的腦突觸體懸液，采用體外給藥，使用RRA方法測定Py對(duì)DAT釋放功能的影響；利用PC12細(xì)胞懸液，運(yùn)用RRA方法檢測農(nóng)藥對(duì)PC12細(xì)胞DAT功能的影響。 結(jié)果：整體動(dòng)物體外試驗(yàn)：與對(duì)照組相比，低劑量的DM和PM處理組DAT的Bmax、Vmax和Kd值降低，高劑量DM組DAT的Bmax、Vmax和Kd值升高，其中Vmax升高30％： 正常大鼠突觸體懸液RRA試驗(yàn)：隨著濃度的升高(從1

9、0-9M～10-4M)，DM促進(jìn)預(yù)先載荷的大鼠紋狀體突觸體釋放[3H]DA的量也隨著增加(從7.16％到升至78.19％)；而在10-9M到10-5M濃度范圍內(nèi)，PM對(duì)紋狀體突觸體釋放[3H]DA的量基本沒什么變化，但當(dāng)濃度達(dá)到(給予突觸體)10-4M時(shí)，突觸體釋放[3H]DA量可降低到25.00％。 細(xì)胞試驗(yàn)：PC12細(xì)胞的DAT對(duì)[3H]DA的攝取呈現(xiàn)時(shí)間和溫度依賴模式，DM抑制PC12細(xì)胞對(duì)[3H]DA的攝取也是一種劑量依

10、賴模式。 結(jié)論：DM使紋狀體DAT功能發(fā)生變化，高劑量PM導(dǎo)致DAT功能失活。DM對(duì)DAT具有特異性的作用。 第四部分溴氰菊酯對(duì)PC12細(xì)胞多巴胺合成的抑制作用 目的：以PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，探討DM對(duì)PC12細(xì)胞多巴胺合成的影響。方法：HPLC測定不同劑量的DM(10-4～10-6M)單獨(dú)或與L-Dopa(20uM、50uM)聯(lián)合給藥，對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)DA含量的影響；FCM及RT-PCR方法測定不同劑量的DM

11、(10-4～10-6M)對(duì)PC12細(xì)胞TH蛋白及mRNA的影響。 結(jié)果：不同劑量的DM(10-4～10-6M)3h或12h給藥，都可以使PC12細(xì)胞內(nèi)DA含量下降，與對(duì)照組相比，有顯著性差異；DM3h或12h給藥，都可以降低L-Dopa所誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)DA含量的升高，不同劑量的DM(10-4～10-6M)3h或12h給藥都可以使PC12細(xì)胞內(nèi)THmRNA和TH蛋白含量下降，與對(duì)照組相比，有顯著性差異。 結(jié)論：DM通

12、過抑制TH而導(dǎo)致DA含量下降，另DM可能還有抑制AADC活性的作用。 第五部分多巴胺受體配體對(duì)PC12細(xì)胞多巴胺釋放的影響 目的：研究多巴胺D1、D2受體激動(dòng)劑或拮抗劑對(duì)DM毒性的作用。 方法：采用HPLC方法測定10-5MDM與高劑量或低劑量的D1、D2受體激動(dòng)劑或拮抗劑3h或12h聯(lián)合給藥后，對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)DA及其釋放分?jǐn)?shù)的影響。 結(jié)果：相對(duì)于DM單獨(dú)給藥來說，多巴胺D2受體拮抗劑氯丙嗪或舒必利與D

13、M聯(lián)合給藥3h和12h后，可以使DA激發(fā)釋放量升高；多巴胺D2受體激動(dòng)劑溴隱亭與DM聯(lián)合給藥后，使DA激發(fā)釋放量降低；而氯氮平(主要拮抗多巴胺D1受體)，則基本上不改變DA激發(fā)釋放量。另聯(lián)合給予DM和PC12細(xì)胞D2受體拮抗劑舒必利或氯丙嗪，相對(duì)與單純給予DM后，增加了DA合成量，但仍顯著低于正常對(duì)照組的DA含量。給藥各組的多巴胺釋放分?jǐn)?shù)均有所下降，其中溴隱亭±DM組的FR值最低，而氯氮平+DM組、舒必利+DM組和氯丙嗪+DM組的FR值

14、與DM組的相比，有所上升。 結(jié)論：D2受體可以調(diào)節(jié)多巴胺的釋放，其拮抗劑增加DA的激發(fā)釋放量，而其激動(dòng)劑則減少DA的激發(fā)釋放量。D1受體則對(duì)多巴胺的激發(fā)釋放沒有影響。DM除了通過D2受體負(fù)反饋途徑抑制TH酶活性及mRNA量外，還可能存在其它的途徑抑制DA的合成。 第六部分?jǐn)M除蟲菊酯對(duì)雄性大鼠腺苷酸環(huán)化酶及紋狀體環(huán)磷酸腺苷水平的影響 目的：研究溴氰菊酯(deltamethrin,DM)和氯菊酯(permethrin

15、,PM)對(duì)雄性SD大鼠大腦皮層及紋狀體腺苷酸環(huán)化酶(adenylylcyclases，AC)蛋白含量和紋狀體環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平的影響。 方法：采用不同劑量的溴氰菊酯、氯菊酯對(duì)雄性SD大鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃給藥后，免疫組化方法測定大鼠大腦皮層及紋狀體AC蛋白含量，及放射免疫方法檢測DM和PM對(duì)大鼠紋狀體cAMP水平的影響。 結(jié)果：DM及PM各處理組的大鼠大腦皮層AC蛋白含量(DM1、DM2、PM1及PM2分別為0.211

16、7±0.0231、0.2101±0.0210、0.2107±0.0254和0.2113±0.0326)與對(duì)照組(0.2578±0.0242)比較，均有顯著下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同劑量DM和PM各組中大鼠大腦紋狀體內(nèi)cAMP水平與對(duì)照組相比均有顯著下降，差異有顯著性。 結(jié)論：擬除蟲菊酯能明顯降低大鼠皮層AC含量，和紋狀體的cAMP水平。 綜上所述，在本研究給藥劑量和給藥時(shí)間下，DM對(duì)黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路有影響，表現(xiàn)為

17、對(duì)黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路的作用是多方位的，如它對(duì)多巴胺能神經(jīng)通路中多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放、攝取以及多巴胺受體等都有影響。其機(jī)制為通過抑制THmRNA及蛋白的合成，抑制TH酶活性，從而減少DA的合成；DM可能調(diào)節(jié)DAT的表達(dá)，使其活性增高，從而對(duì)DA的攝取增加；此外，DM可能通過D2受體負(fù)反饋途徑抑制TH酶活性及mRNA表達(dá)，調(diào)節(jié)DA的合成。關(guān)于流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥是以黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路為病變特征的神經(jīng)退行性疾病如PD、