野桑蠶和家蠶對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯抗性的研究.pdf

1、野桑蠶(Bombyx mandarina)和家蠶(Bombyx mori)為鱗翅目昆蟲(chóng)。對(duì)野桑蠶和家蠶進(jìn)行擬除蟲(chóng)菊酯抗性的比較研究，將為鱗翅目害蟲(chóng)的防治和家蠶抗性育種提供重要的理論依據(jù)。擬除蟲(chóng)菊酯的作用靶標(biāo)是神經(jīng)軸突上的鈉離子通道蛋白(sodium channelprotein)，而細(xì)胞色素P450第九家族的多個(gè)基因與昆蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯抗性有關(guān)。本文測(cè)定了溴氰菊酯對(duì)野桑蠶和家蠶的毒力，進(jìn)行了抗溴氰菊酯野桑蠶的篩選，克隆了野桑蠶和家蠶的鈉離

2、子通道蛋白基因，分析了氯氰菊酯對(duì)野桑蠶和家蠶CYP9家族基因的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，獲得的主要結(jié)果如下： 1.野桑蠶擬除蟲(chóng)菊酯抗藥性和鈉離子通道蛋白基因的克隆 1．1溴氰菊酯對(duì)野桑蠶和家蠶的毒力比較 采用點(diǎn)滴法測(cè)定了溴氰菊酯對(duì)野桑蠶和家蠶的毒力。吳江野桑蠶(YWJ)、啟東野桑蠶(YQD)和蘇大野桑蠶(YSD)分別是家蠶品種大造(Dazao)的15．89倍、11．67倍、10．11倍，家蠶品種L11是大造的4．37倍。

3、 1．2野桑蠶對(duì)溴氰菊酯抗性品系的篩選 在桑葉育條件下，蘇大野桑蠶經(jīng)連續(xù)3代溴氰菊酯篩選，S4代抗藥性倍數(shù)為16．48倍，S4代LDso(0．445 ng/頭)值較S0代LD50(0．237 ng/頭)提高了0．9倍。在人工飼料飼育條件下，吳江野桑蠶經(jīng)6代人工飼料育和3代溴氰菊酯篩選，S6代抗藥性倍數(shù)為18．67倍，S6代LD50(0．504 ng/頭)值較S0代LD50(0．418 ng/頭)值提高了0．2倍。 1．3

4、野桑蠶和家蠶para型鈉離子通道蛋白基因結(jié)構(gòu)域II的克隆與突變 根據(jù)家蠶鈉離子通道蛋白基因部分序列(GenBank登錄號(hào)：EF521818)，設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)RT-PCR方法，克隆了編碼吳江野桑蠶(YWJ)和家蠶品種大造的鈉離子通道蛋白結(jié)構(gòu)域II的cDNA片段。兩片段長(zhǎng)均為1135bp，編碼378個(gè)氨基酸，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與擊倒抗性(knock down resistance，kdr)相關(guān)的點(diǎn)突變，但發(fā)現(xiàn)2個(gè)點(diǎn)突變1164L和V196

5、A，推測(cè)可能這兩個(gè)突變與野桑蠶對(duì)溴氰菊酯的抗性有關(guān)。 1．4野桑蠶和家蠶para型鈉離子通道蛋白基因的克隆與選擇性剪切 根據(jù)家蠶鈉離子通道蛋白基因部分序列(GenBank登錄號(hào)：BK005824，EF521818)，設(shè)計(jì)引物，分段RT-PCR，克隆了家蠶大造鈉離子通道蛋白基因Bmpara(GenBank登錄號(hào)：EU688970)和吳江野桑蠶鈉離子通道蛋白基因Bmmpara。根據(jù)克隆的野桑蠶鈉離子通道蛋白基因序列和家蠶基因

6、組序列，設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法，克隆到3段野桑蠶基因組序列。序列分析表明，Bmpara的cDNA長(zhǎng)為5555 bp，編碼1851個(gè)氨基酸；Bmmpara的cDNA有6種，長(zhǎng)度分別為5555 bp、5594 bp、5432 bp、5522 bp、5561bp、5399bp，分別編碼1851、1864、1810、1840、1853、1799個(gè)氨基酸；3段野桑蠶基因組序列長(zhǎng)度分別為1632 bp、536 bp、3220 bp。將Bmpara

7、和Bmmpara的eDNA與家蠶基因組Blast分析和野桑蠶基因組片段比對(duì)，結(jié)果表明，Bmpara有34個(gè)外顯子和33個(gè)內(nèi)含子，Bmmpara除了與Bmpara有相同結(jié)果外，還發(fā)現(xiàn)Bmmpara有a(11個(gè)氨基酸ENDLGRTKKKK)、b(13個(gè)氨基酸GLKAALCGRCVSS)、c(41個(gè)氨基酸SLINFVAALCGAGGIQAFKTMRTLRALRPLRAMSRMQGMRV)3個(gè)選擇性微外元，可能存在6種選擇性剪接，構(gòu)成野桑蠶鈉離

8、子通道蛋白不同亞型。 2.野桑蠶和家蠶細(xì)胞色素P450的誘導(dǎo)與抗藥性研究 2．1野桑蠶細(xì)胞色素P450氧化酶活性測(cè)定及CYP9家族基因的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄 采用酶標(biāo)板酶活性動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)了氯氰菊酯誘導(dǎo)蘇大野桑蠶中腸和脂肪體的PNOD活性，結(jié)果表明：氯氰菊酯誘導(dǎo)24 h，脂肪體、中腸PNOD活性分別增加了18．7％、12．2％。根據(jù)家蠶CYP9家族基因序列，設(shè)計(jì)引物，克隆了野桑蠶CYP9A21基因(GenBank登錄號(hào)：FJ2

9、65741)、CYPgA22基因(GenBank登號(hào)：EF535806)和CYP9G3基因片斷。用半定量RT-PCR方法分析了氯氰菊酯誘導(dǎo)野桑蠶CYP9家族基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明，氯氰菊酯誘導(dǎo)24 h，cYP9A21基因在中腸的mRNA表達(dá)量是對(duì)照的2．1倍，CYP9A20、CYP9A21、CYP9G3基因在脂肪體的mRNA表達(dá)量是對(duì)照的1．9、3．5、1．4倍。推測(cè)野桑蠶CYP9A21等基因的的過(guò)量表達(dá)可能導(dǎo)致野桑蠶對(duì)氯氰菊酯氧化解

10、毒代謝的增強(qiáng)。 2．2家蠶CYP9家族基因的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄及CYP9A22的克隆與序列分析 用半定量RT-PCR方法分析氯氰菊酯誘導(dǎo)家蠶CYP9家族基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明，氯氰菊酯誘導(dǎo)家蠶24 h， CYP9A20基因的中腸、CYP9A22基因的脂肪體、cYP9G3的脂肪體的mRNA表達(dá)量分別是對(duì)照的1．3、3．1、1．2倍。與野桑蠶相比，家蠶CYP9家族基因被誘導(dǎo)的mRNA表達(dá)量低，推測(cè)這可能是家蠶比野桑蠶對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯更敏

11、感的原因之一。采用RACE策略，克隆了CYP9A22基N(GenBank登錄號(hào)：EF535804)。該基因cDNA全長(zhǎng)1707 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)1596 bp，編碼531個(gè)氨基酸，推定的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為61 kD，等電點(diǎn)為7．71，與已知的CYP9家族的CYP9A14基因(棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera)的氨基酸同源性達(dá)到62．3％。利用NNPP分析軟件預(yù)測(cè)出轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，與根據(jù)CYP9A22全長(zhǎng)cDNA序列推測(cè)的結(jié)果是一