流體切應(yīng)力對(duì)hBMSCs生物學(xué)功能影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、在外科臨床嚴(yán)重創(chuàng)傷修復(fù)和手術(shù)治療中常需要血管移植物，自體血管取材受限，但是小于5mm直徑的人工血管或在血流速度較慢的大口徑應(yīng)用的人工血管早期即易形成血栓。組織工程血管（TEBVs）是研究的方向之一，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是重要的種子細(xì)胞來源。目前TEBVs研究的瓶頸是種子細(xì)胞在體內(nèi)流體切應(yīng)力作用下粘附和功能不理想，容易出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、脫落，使移植失敗，但是目前尚沒有流體切應(yīng)力對(duì)TEBVs種子細(xì)胞BMSCs活性功能影響的研究報(bào)道。因

2、此研究流體切應(yīng)力對(duì)TEBVs種子細(xì)胞BMSCs生物學(xué)功能的影響及其分子機(jī)制，對(duì)TEBVs構(gòu)建具有重要的意義。
　　目的
　　1．研究出切應(yīng)力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡及活性的影響。
　　2．明確在流體切應(yīng)力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能活性影響的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和相關(guān)基因，找到改進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能的基因靶點(diǎn)。
　　3．研究出流體切應(yīng)力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能活性影響的分子機(jī)制，為改進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為TEBVs種子細(xì)胞的

3、功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法
　　1.采用傳統(tǒng)的梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs），經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面特征CD分子鑒定，并將其誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，并采用骨鈣素免疫組化染色和油紅O染色進(jìn)行鑒定。
　　2.對(duì)第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別給予3、10和30dyne/cm2的流體切應(yīng)力2h，6h，24h，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞增殖曲線，應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察增殖及凋亡，檢測(cè)Caspase3活性和hBMSCs釋

4、放的LDH活性。
　　3.對(duì)給予3dyne/cm2切應(yīng)力6h的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的蛋白質(zhì)采用二維凝膠電泳，以靜態(tài)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為對(duì)照，將發(fā)生差異的蛋白質(zhì)予以質(zhì)譜分析，同時(shí)用免疫熒光染色和westernblotting的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　4.將3dyne/cm2切應(yīng)力作用6h后的hBMSCs為實(shí)驗(yàn)組，以靜態(tài)培養(yǎng)的hBMSCs為對(duì)照組，通過黏附基因芯片采用OligoGEARRay基因芯片實(shí)驗(yàn)方法和通過凋亡基因芯片采用O

5、ligoGEARRay基因芯片實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行對(duì)照研究，并應(yīng)用rt-PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果，以尋找切應(yīng)力下hBMSCs變化的關(guān)鍵基因。
　　5.對(duì)hBMSCs施加不同流體切應(yīng)力，觀察細(xì)胞增殖、凋亡和活性功能同時(shí)，針對(duì)切應(yīng)力下hBMSCs凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵基因應(yīng)用外源性抑制劑重組基因cIAP1干預(yù)和cIAP1拮抗劑DIABLO反向干預(yù)，研究切應(yīng)力下影響hBMSCs活性功能的機(jī)制。
　　結(jié)果
　　1.所獲得的細(xì)胞符合骨髓間

6、充質(zhì)干細(xì)胞特征，hBMSCs的表面抗原分子CD29和CD105陽性，CD45、CD34和CD14均為陰性。骨鈣素免疫組化染色和油紅O染色均呈陽性，可證明能夠定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。
　　2.3dyne/cm2切應(yīng)力下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2h和6h時(shí)，細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，G2+S期的細(xì)胞百分比顯著增高，hBMSCs發(fā)生凋亡壞死顯著。而3dyne/cm2切應(yīng)力和10dyne/cm2切應(yīng)力作用24h時(shí)，可見平板流動(dòng)腔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減

7、少，30dyne/cm2切應(yīng)力作用下，細(xì)胞發(fā)生顯著脫落，作用時(shí)間越長細(xì)胞脫落越顯著，hBMSCs在各組切應(yīng)力作用6h時(shí)即發(fā)生顯著的凋亡、壞死。各切應(yīng)力作用2h時(shí)和3dyne/cm2切應(yīng)力作用6h時(shí)hBMSCs中Caspase3活性活性和LDH活性均未發(fā)生顯著變化；在10dyne/cm2切應(yīng)力及30dyne/cm2切應(yīng)力作用6h時(shí)，hBMSCs的Caspase3活性和LDH活性顯著增加。
　　3.蛋白組學(xué)研究成功鑒定出切應(yīng)力作用于h

8、BMSCs后差異蛋白質(zhì)點(diǎn)32個(gè)，其中蛋白質(zhì)表達(dá)顯著上調(diào)有10種，蛋白質(zhì)表達(dá)顯著下調(diào)有3種。其中經(jīng)免疫熒光染色和westernblotting顯示GAPDH和AnnexinA2表達(dá)確實(shí)顯著上調(diào)。
　　4.通過對(duì)3dyne/cm2切應(yīng)力作用6h后的hBMSCs基因芯片研究結(jié)果顯示，有6種在切應(yīng)力作用下顯著變化的黏附基因，其中4種基因表達(dá)上調(diào)超過2倍，分別為ECM-1、ICAM-1、cSPG7、TIMP2；2種基因表達(dá)下調(diào)超過2倍，分別

9、為LAMA4和VCAM1。同時(shí)有5種在切應(yīng)力作用下顯著變化的凋亡基因，其中有2種表達(dá)顯著上調(diào)超過2倍的凋亡基因分別為APAF1和BOK。對(duì)基因芯片發(fā)現(xiàn)的6種顯著變化的粘附基因和5種顯著變化的凋亡基因進(jìn)行了rt-PCR檢測(cè)，顯示基因ECM-1、ICAM-1、cSPG7、TIMP2顯著增高（P＜0.001和P＜0.01），而基因LAMA4和VCAM1顯著降低（P＜0.001），基因APAF1和BOK顯著增高（P＜0.001和P＜0.01），

10、從而驗(yàn)證了基因芯片的準(zhǔn)確性。3dyne/cm2切應(yīng)力作用2h后，hBMSCscIAP1水平升高（P＜0.05），但30dyne/cm2切應(yīng)力作用后,hBMSCscIAP1水平均降低（P＜0.05）。
　　5.應(yīng)用Caspase抑制劑外源性重組cIAP1干預(yù)Caspase3的活性和LDH活性均降低，hBMSCs的凋亡減少，細(xì)胞增殖增加。加入cIAP1抑制劑DIABLO反向干預(yù)后，Caspase3活性和LDH活性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡顯著增加

11、。
　　結(jié)論
　　1.首先研究發(fā)現(xiàn)低切應(yīng)力（3dyne/cm2）作用較短時(shí)間（≤6h）時(shí)可促進(jìn)hBMSCs增殖，hBMSCs未發(fā)生顯著凋亡，同時(shí)內(nèi)源性cIAP1上調(diào)；但在3dyne/cm2作用12h和10dyne/cm2以及30dyne/cm2流體切應(yīng)力下6h時(shí)hBMSCs增殖受到抑制，細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡壞死，活性功能明顯減低。切應(yīng)力越大細(xì)胞凋亡壞死越顯著。為hBMSCs種子細(xì)胞在體外應(yīng)用切應(yīng)力預(yù)適應(yīng)、改善種子細(xì)胞的活性功能打

12、下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2.蛋白質(zhì)組學(xué)研究和基因芯片的篩選，首先發(fā)現(xiàn)3dyne/cm2的切應(yīng)力作用6h后hBMSCs細(xì)胞AnnexinA2和GAPDH表達(dá)顯著上調(diào)，有6種粘附相關(guān)基因及5種凋亡相關(guān)基因發(fā)生顯著變化，其中凋亡相關(guān)基因APAF1和BOK在切應(yīng)力作用下顯著增強(qiáng)，顯示hBMSCs在切應(yīng)力作用下凋亡與APAF1、BOK和Caspase凋亡基因的啟動(dòng)相關(guān)。為進(jìn)一步改進(jìn)種子細(xì)胞功能提供了基因靶點(diǎn)。
　　3.應(yīng)用Caspase9抑

13、制劑干預(yù)可降低Caspase3的活性和LDH活性，減少hBMSCs的凋亡，細(xì)胞增殖增加；加入cIAP1拮抗劑反向干預(yù)后Caspase3活性和LDH活性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡顯著增加。從而首先實(shí)驗(yàn)證實(shí)hBMSCs在切應(yīng)力作用下是通過激活了凋亡信號(hào)通路機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)hBMSCs活性功能下降。
　　4.首先應(yīng)用外源性重組cIAP1干預(yù)可以實(shí)現(xiàn)抑制Caspase3的活性和LDH活性，減少hBMSCs在切應(yīng)力作用下的凋亡，使細(xì)胞增殖和活性增