VDR基因?qū)PCs生物學(xué)功能的影響.pdf

1、腎臟是機(jī)體供血量最豐富的器官，其多種功能均通過血管得到實(shí)現(xiàn)，如腎小球?yàn)V過、腎小管重吸收等重要生理過程，且目前研究證實(shí)血管損害的嚴(yán)重程度與腎臟疾病的預(yù)后關(guān)系密切，因此，維持血管正常結(jié)構(gòu)及功能對實(shí)現(xiàn)腎臟功能至關(guān)重要。早期血管損害表現(xiàn)為VEC受損、平滑肌細(xì)胞遷移及基質(zhì)增生等，其中VEC受損是始動(dòng)環(huán)節(jié)，而晚期血管損害則表現(xiàn)為解剖結(jié)構(gòu)的改變?nèi)缪芫植炕?、狹窄、斷裂甚至完全阻塞進(jìn)而影響血供。血管損傷治療方法包括病因治療、藥物治療和手術(shù)治療等。藥物

2、主要有抗氧化劑、降壓藥、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體抑制劑等，但藥物療效甚微僅能夠緩解血管損害進(jìn)展而并不能從根本上修復(fù)血管。臨床上可通過支架置入、血管成形術(shù)等外科手段治療血管晚期損害，但手術(shù)治療創(chuàng)傷大、風(fēng)險(xiǎn)高，且干預(yù)時(shí)機(jī)晚。研究者發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)VEC一旦受損，骨髓中EPCs就可被動(dòng)員、遷移、歸巢、分化為成熟VEC，以取代損傷的VEC進(jìn)而修復(fù)血管。研究者提出EPCs移植治療法，且多項(xiàng)動(dòng)物和人體干預(yù)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)EPCs移植對組織缺血療效

3、良好。因其療效好，創(chuàng)傷小，干預(yù)時(shí)機(jī)早，EPCs移植治療已成為血管性疾病的新希望。但該技術(shù)目前仍面臨一些問題如血管修復(fù)需大量EPCs，而骨髓中數(shù)量少，體外培養(yǎng)擴(kuò)增不能滿足需求，且體外成血管能力不穩(wěn)定。因此，關(guān)于EPCs增殖和成血管能力的研究必將受到關(guān)注。
　　研究顯示VD缺乏與心血管疾病明顯關(guān)聯(lián)，VD干預(yù)對心血管相關(guān)疾病有一定益處，但作用機(jī)制尚不清楚。EPCs中也存在VDR表達(dá)，利用VD干預(yù)可促進(jìn)EPCs增殖及成血管能力，并呈VDR

4、數(shù)量依賴性，提示VDR與EPCs增殖及成血管能力有關(guān)。VDR作為核受體與配體-VD結(jié)合可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，影響EPCs的增殖、凋亡及衰老，但近期有研究表明VDR可作為第二信使對細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用。那么，VDR在沒有VD干預(yù)的情況下，能否獨(dú)立地對EPCs的生物學(xué)功能進(jìn)行調(diào)控？VDR基因提前轉(zhuǎn)染至EPCs中是否會(huì)有利于EPCs移植的治療效果？目前并無相關(guān)研究。
　　目的:初步研究不同水平VDR基因?qū)PCs增殖、凋亡、衰老、細(xì)胞周期及遷移的

5、影響，為EPCs移植治療提供新的視角和理論基礎(chǔ)。
　　方法:(1)分離大鼠骨髓源單核細(xì)胞，定向誘導(dǎo)分化EPCs，并應(yīng)用免疫熒光染色鑒定。(2)構(gòu)建Ad-VDR和Ad-VDR shRNA。分別轉(zhuǎn)染Ad-VDR/Ad-VDR shRNA至EPCs中，以未處理EPCs為對照組，檢測各組VDR mRNA(RT-PCR法)和VDR蛋白質(zhì)(WB法)相對表達(dá)水平。(3)設(shè)立6個(gè)組:正常水平組即EPCs未處理組、高水平組即轉(zhuǎn)染Ad-VDR至EPC

6、s中、低水平組即轉(zhuǎn)染Ad-VDR shRNA至EPCs中、正常水平+Rapamycin組、高水平+Rapamycin組及低水平+Rapamycin組。分別檢測各組EPCs增殖(MTT法和BrdU法)、凋亡(FACS法和WB法)、衰老（β-半乳糖苷酶染色法）、細(xì)胞周期(FACS法)和遷移（侵襲小室法）。
　　結(jié)果:(1)成功分離大鼠骨髓源單核細(xì)胞，經(jīng)定向誘導(dǎo)分化，免疫熒光染色鑒定細(xì)胞為CD34+/CD133+/VEGFR2+細(xì)胞，是

7、目前公認(rèn)的EPCs。(2)轉(zhuǎn)染Ad-VDR至EPCs組的VDR mRNA及VDR蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯高于對照組，而轉(zhuǎn)染Ad-VDR shRNA至EPCs組的VDR mRNA及VDR蛋白質(zhì)表達(dá)量均明顯低于對照組。(3)相對于對照組別，高水平組別OD值和BrdU LI均增高，而低水平組別OD值和BrdU LI均降低。高水平組別Caspase3表達(dá)量降低，而低水平組別FACS所檢測凋亡率和Caspase3表達(dá)量均增高。在衰老檢測中，低水平組別

8、中衰老細(xì)胞數(shù)增多，高水平組別和正常水平組別對比無顯著差異。高水平組別中G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例增高，而低水平組別S期細(xì)胞比例降低，甚至在低水平+ Rapamycin組無S期細(xì)胞，G2期細(xì)胞比例增高。在遷移檢測中，高水平組別中EPCs遷移細(xì)胞數(shù)明顯增多，低水平組別與正常水平組別對比無顯著差異。
　　結(jié)論:一定水平的VDR基因?qū)S持EPCs正常功能是必需的;VDR基因呈低表達(dá)水平時(shí)， EPCs的增殖受抑、凋亡和衰老增加、G2/